穆培霞，馬 玲，付冬冬，楊學(xué)華，呂書龍，吳 潔，范文強(qiáng)

1)新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院特需二科 河南新鄉(xiāng)453000 2)新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 河南新鄉(xiāng) 453000 3)新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科 河南新鄉(xiāng) 453000 4)新鄉(xiāng)市中醫(yī)院風(fēng)濕科 河南新鄉(xiāng)453000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要以侵蝕性、慢性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)，是一種自身免疫性疾病?；そM織異常是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生的關(guān)鍵，其中滑膜細(xì)胞凋亡障礙和炎癥因子分泌是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生的主要原因[1]。艾拉莫德是一種抗風(fēng)濕新藥，具有抗炎、抑制免疫球蛋白產(chǎn)生等作用[2]。有報(bào)道[3]顯示，艾拉莫德可改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)疼痛，并且對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖和免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。該研究觀察了艾拉莫德對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的作用，探討艾拉莫德治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料收集2018年1至8月新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)切除的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)滑膜組織，標(biāo)本采集經(jīng)患者及家屬知情同意。艾拉莫德購(gòu)自海南先聲藥業(yè)有限公司，胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，活化的Caspase-3(C-Caspase-3)抗體、Bcl-XL抗體、NF-κBp65抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，細(xì)胞色素C抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，IL-1β含量檢測(cè)試劑盒、TNF-α含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰?。

1.2類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[4]，滑膜組織以PBS洗滌后剪成約1 mm3的碎塊，添加0.8 g/L Ⅱ型膠原酶，37 ℃孵育4 h。1 000×g離心10 min，吸棄上清，添加2.5 g/L胰蛋白酶，37 ℃孵育0.5 h。以120目的濾網(wǎng)過濾，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取第3代滑膜細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞分組處理滑膜細(xì)胞分別用含艾拉莫德終質(zhì)量濃度為0、600、1 200、1 800 μg/L[5]的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

1.4Annexin-V FITC/PI雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡取4組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。移液槍吸取1 mL細(xì)胞懸液，以200 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，添加PI和 Annexin-V FITC染液5 μL，避光、室溫下靜置20 min，加300 μL緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α含量取4組細(xì)胞的培養(yǎng)液，采用ELISA法測(cè)定IL-1β、TNF-α含量，按照試劑盒說明操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western blot法測(cè)定細(xì)胞中C-Caspase-3、Bcl-XL、NF-κBp65以及胞質(zhì)和線粒體中細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)取4組細(xì)胞，分別提取細(xì)胞總蛋白、胞質(zhì)蛋白和線粒體蛋白。取總蛋白與上樣緩沖液混勻后，100 ℃反應(yīng)5 min。按照每孔40 μg蛋白樣品上樣，設(shè)置80 V電壓電泳約30 min，調(diào)整電壓到120 V，觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入到凝膠底部，終止電泳。取出蛋白凝膠，轉(zhuǎn)膜，然后將NC膜放在50 g/L牛血清白蛋白溶液中孵育2 h，依次加一抗(C-Caspase-3、Bcl-XL和NF-κBp65抗體，稀釋比例分別為1∶400、1∶600、1∶400)、二抗(稀釋比例為1∶2 000)充分孵育。ECL顯色后，用Image J掃描條帶灰度值，分析蛋白表達(dá)變化。同上方法檢測(cè)胞質(zhì)和線粒體中細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)(一抗稀釋比例為1∶800)。細(xì)胞中C-Caspase-3、Bcl-XL、NF-κBp65以及胞質(zhì)中細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參，線粒體中細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)以Porin為內(nèi)參。目的蛋白表達(dá)水平為目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。4組間以上各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞凋亡率和培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α含量的比較不同劑量艾拉莫德處理后，滑膜細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α含量降低(表1)。

表1 4組細(xì)胞凋亡率及培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α含量的比較(n=3)

*：與0 μg/L艾拉莫德組比較，P<0.05；#：與600 μg/L艾拉莫德組比較，P<0.05；△：與1 200 μg/L艾拉莫德組比較，P<0.05

2.2各組細(xì)胞中C-Caspase-3、Bcl-XL、NF-κBp65及胞質(zhì)和線粒體中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平的比較見圖1～3和表2。

1～4:分別為0、600、1 200、1 800 μg/L艾拉莫德組

1～4:分別為0、600、1 200、1 800 μg/L艾拉莫德組

不同劑量艾拉莫德處理后，C-Caspase-3蛋白水平升高，Bcl-XL和NF-κBp65蛋白表達(dá)水平下降，滑膜細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平升高，線粒體中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平下降。

表2 各組細(xì)胞中C-Caspase-3、Bcl-XL、NF-κBp65及胞質(zhì)和線粒體中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

*：與0 μg/L艾拉莫德組比較，P<0.05；#：與600 μg/L艾拉莫德組比較，P<0.05；△：與1 200 μg/L艾拉莫德組比較，P<0.05

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性自身免疫性疾病，能夠侵襲并破壞局部關(guān)節(jié)組織，具有高致殘率[5]。研究[6]顯示，滑膜細(xì)胞功能異常改變是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要原因，滑膜細(xì)胞能夠釋放多種炎癥因子進(jìn)入血液以及滑液中，這些細(xì)胞因子能夠進(jìn)一步刺激周圍炎性細(xì)胞以及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞等釋放更多的損傷因子而破壞關(guān)節(jié)軟骨；另外，滑膜細(xì)胞凋亡障礙也是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生的關(guān)鍵。

艾拉莫德是一種具有抗炎以及免疫調(diào)節(jié)作用的小分子藥物，屬于對(duì)氧萘酮衍生物[7]。研究[8]顯示，艾拉莫德具有顯著的抗關(guān)節(jié)破壞功效，能夠減輕組織炎癥反應(yīng)，可改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜損傷[9]。本研究結(jié)果表明，艾拉莫德可誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制炎癥因子的分泌。

研究[10-11]顯示，細(xì)胞凋亡的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)多種調(diào)控途徑有關(guān)。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要途徑之一，其關(guān)鍵是線粒體中的細(xì)胞色素C釋放入胞質(zhì)，誘導(dǎo)下游凋亡蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase和Bcl-2蛋白家族是目前發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切的調(diào)控因子[12]。Caspase-3是位于細(xì)胞凋亡反應(yīng)下游的凋亡執(zhí)行因子，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮不可逆的誘導(dǎo)作用[13]。Bcl-XL是Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白[14]。本研究結(jié)果顯示，艾拉莫德處理后的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中線粒體細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平降低，胞質(zhì)細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平升高，C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-XL蛋白表達(dá)水平下降，說明艾拉莫德可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

NF-κB是一個(gè)多功能調(diào)節(jié)因子，對(duì)于細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)均有重要作用，其可以激活細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)，同時(shí)可以通過多種途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡發(fā)生[15-16]。研究[17]表明，Bcl-XL有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB激活可以引起B(yǎng)cl-XL表達(dá)水平升高，從而抑制細(xì)胞凋亡。NF-κB激活可以抑制線粒體細(xì)胞色素C釋放，從而抑制Caspase凋亡反應(yīng)的發(fā)生[18]。NF-κB還可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞中炎癥因子如IL-1β、TNF-α的釋放從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[19]。NF-κBp65是NF-κB功能發(fā)揮的關(guān)鍵亞單位，也是NF-κB信號(hào)通路激活的標(biāo)志[20]。本研究結(jié)果顯示，艾拉莫德可以減少類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中NF-κBp65的表達(dá)，說明艾拉莫德可能通過抑制NF-κB激活調(diào)控線粒體凋亡途徑，從而誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞炎癥因子釋放。

目前對(duì)于艾拉莫德在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放中的具體調(diào)控機(jī)制還不明確，在以后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)繼續(xù)探討。