廖林曉，王樹娟，王 沖，劉延方，常銀銀，王偉瓊，馬 杰，李 濤，陳勝梅，姜中興

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 鄭州450052 2)上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司 上海201400

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)和骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是髓系惡性疾病，目前認為其多數(shù)患者存在基因突變；隨著二代測序技術(shù)的臨床應(yīng)用，AML和MDS的基因突變?nèi)找媸艿街匾昜1-2]。臨床上觀察到MDS可以進展為AML，而其驅(qū)動基因仍不清楚。比較MDS和AML患者基因突變譜的異同，有助于理解髓系惡性疾病演化過程的內(nèi)在分子機制。本研究通過二代測序技術(shù)比較分析AML和MDS的22種常見基因突變率的差異，為更好揭示AML和MDS發(fā)生的分子機制提供初步依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象本研究共納入2017年6月至2019年1月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科診治的749例AML和218例MDS患者。 AML患者的中位年齡為48(14～86)歲，男400例,女349例;檢測時疾病狀態(tài)為初診703例，復(fù)發(fā)14例，MDS轉(zhuǎn)化的AML 32例;MDS患者的中位年齡為54(17～86)歲，其中男122例，女96例。所有患者均依據(jù)2016版WHO血液腫瘤分類標準[3]進行診斷分型，并應(yīng)用二代測序技術(shù)對其骨髓標本進行基因突變檢測(倫理審查編號：2019-KY-194)。

1.2基因突變的檢測使用肝素鋰采血管收集AML或者MDS患者治療前的骨髓液2 mL，提取單個核細胞，應(yīng)用常規(guī)方法提取DNA，取1 μg DNA制備DNA全基因組文庫。采用AML/MDS二代測序基因芯片(上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司)，PCR擴增目的基因(AML/MDS 相關(guān)22個突變基因)，將目標區(qū)域DNA富集后，采用Illumina測序平臺進行測序。測序后的原始數(shù)據(jù)利用NCBI、CCDS、dbSNP(v138)、COSMIC、人基因組數(shù)據(jù)庫(HG19)等數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析，確定致病性突變位點，平均測序深度為4 837.978 kb。檢測的22個基因按照功能分8類[4-6]：甲基化相關(guān)基因(DNMT3A、IDH1、IDH2和TET2)，染色質(zhì)修飾相關(guān)基因(ASXL1、EZH2)，激酶相關(guān)性基因(FLT3、KIT、JAK2)，NPM1基因(NPM1)，RAS途徑基因(CBL、NRAS)，剪接體相關(guān)基因(SF3B1、SRSF2、U2AF1、ZRSR2)，轉(zhuǎn)錄因子基因(CEBPA、ETV6、SETBP1、RUNX1)，腫瘤因子抑制物相關(guān)基因(TP53、PHF))。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)分析。AML和MDS患者基因突變率的比較應(yīng)用χ2檢驗、校正χ2檢驗或Fisher精確概率法，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1AML和MDS基因突變的譜系分析MDS患者中有142例(142/218，65.1%)檢測到基因突變；AML患者中有577例(577/749，77.0%) 檢測到基因突變，基因突變率高于MDS(χ2=12.536，P<0.001)。與MDS相比較，AML患者中甲基化相關(guān)基因(31.8%vs16.1%；χ2=20.596，P<0.001)、激酶相關(guān)性基因(27.0%vs4.1%；χ2=51.640，P<0.001)、NPM1 基因 (17.8%vs5.0%；χ2=21.526，P<0.001) 和 RAS途徑基因(14.7%vs6.4%；χ2=10.316，P=0.001)突變率增高；而染色質(zhì)修飾相關(guān)基因(5.7%vs17.4%；χ2=30.067，P<0.001) 和剪接體相關(guān)基因(10.3%vs36.2%；χ2=84.094，P<0.001)突變率降低；轉(zhuǎn)錄因子基因(18.4%vs17.9%；χ2=0.032,P=0.857)和腫瘤因子抑制物相關(guān)基因(3.9%vs6.4%；χ2=2.584,P=0.108)突變在AML和MDS之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2AML和MDS患者中22個基因突變率的比較見表1。

2.3年齡對基因突變的影響60歲以下中青年AML患者中基因突變率(>10%)高于MDS的基因有FLT3(18.9%vs0.7%；χ2=27.373,P<0.001)、NPM1(16.3%vs6.0%；χ2=9.493，P=0.002)、NRAS (15.3%vs6.7%；χ2=6.805，P=0.009)和CEBPA(11.9%vs2.2%；χ2=11.219，P=0.001)；MDS患者中基因突變率(>10%)高于AML的基因有ASXL1(15.7%vs5.1%；χ2=18.571,P<0.001)和U2AF1(26.1%vs6.0%；χ2=50.694,P<0.001)。在60歲以上的AML患者中基因突變率(>10%)高于MDS的基因有DNMT3A(14.9%vs6.0%；χ2=4.241,P=0.039)、IDH2(16.1%vs2.4%；χ2=10.337,P=0.001)、FLT3(23.0%vs3.6%；χ2=15.233,P<0.001)和NPM1(23.0%vs3.6%；χ2=15.233,P<0.001)；MDS患者中基因突變率(>10%)高于AML的基因有SF3B1(11.9%vs4.3%；χ2=4.882,P=0.027)和U2AF1(15.5%vs5.6%；χ2=6.601,P=0.010)。

表1 AML和MDS患者中22個基因突變率的比較突變例數(shù)(%)

3 討論

AML和MDS是一組順序性、多基因、多步驟參與發(fā)病的高度異質(zhì)性疾病，基于二代測序技術(shù)的候選基因擴增子測序技術(shù)使得AML和MDS中一些新的基因突變不斷地被發(fā)掘出來，有助于探索AML和MDS仍未被認識的發(fā)病機制，從而尋找新的治療靶點。隨著骨髓原始細胞比例的增多，造血干細胞的惡性克隆也在逐漸擴增[7]，然而在這一過程中基因突變的演變情況尚不明確。既往文獻[8-10]分別研究了MDS和AML基因突變表達譜，但對MDS和AML的基因突變表達譜的對比性分析鮮有研究。

本研究中，967例患者總體中存在基因突變者719例(74.4%)，其中749例AML患者中存在基因突變者577例(77.0%)，與Hussaini等[11]報道的70%相似。我國學(xué)者 Cao等[12]報道的AML中突變率最高的為CEBPA，其次為TET2和ASXL1，與本研究AML中發(fā)生率最高的為FLT3，其次為NPM1和NRAS不同；Hosono[13]關(guān)于MDS基因突變譜的研究表明MDS患者中SF3B1、TET2和ASXL1基因突變頻率位于前三位，不同于本研究中的U2AF1、ASXL1和RUXL1；而MDS中剪接體相關(guān)基因的突變率最高，兩研究中保持一致。以上不同可能與樣本中患者生活的環(huán)境、國內(nèi)外人種的差異、二代測序儀器的敏感性以及各中心選取數(shù)據(jù)的偏倚有關(guān)。本研究通過檢索國內(nèi)外各大數(shù)據(jù)庫，確定與白血病相關(guān)的突變位點，排除了目前致病意義不明的單核苷酸多態(tài)性序列(如 TET2:P29R/I1762V/V218M等)，因此本研究的總體基因突變率低于國內(nèi)學(xué)者[14-15]的研究，單個基因突變的陽性率也與之不盡相同。

本研究數(shù)據(jù)顯示，AML患者總體的基因突變率高于MDS患者，這也可能是AML患者相較MDS患者起病更急、進展更快、生存率更低的原因之一。Ganguly等[16]在綜述中指出剪接體相關(guān)基因和甲基化相關(guān)基因被描述為惡性血液病發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動事件，染色質(zhì)修飾基因以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因則在突變后期發(fā)生并且屬亞克隆突變。但在本研究中，與MDS患者相比，AML患者甲基化相關(guān)基因突變率增加，而剪接體相關(guān)基因突變率降低；這說明各功能組基因不僅在疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，不同功能組基因之間可能也存在著復(fù)雜的相互作用。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，造血干細胞和祖細胞中Asxl1和Nf1的缺失導(dǎo)致MYC、NRAS和BRD4等通過多種途徑獲得轉(zhuǎn)錄激活，而這一改變促進了髓系腫瘤的進展。Benetatos等[18]研究表明，甲基化途徑是導(dǎo)致MDS伴原始細胞增多患者向AML進展的機制之一，與本研究中甲基化相關(guān)基因突變率的變化相互印證。對比AML和MDS患者中的單個基因突變，AML患者中NPM1、FLT3、DNMT3A CEBPA NRAS等基因突變率增高，而MDS患者中ASXL1、U2AF1及RUNX1等基因突變率增高，AML和MDS患者的基因突變譜呈現(xiàn)明顯的不同。進一步研究這些差異性突變基因在AML和MDS發(fā)生發(fā)展中所起的作用，必將有助于理解其發(fā)生發(fā)展機制，尤其是有助于尋找MDS向AML演變的驅(qū)動基因，為未來的靶向治療提供依據(jù)。

在60歲以下的患者中，CEBPA、NRAS、NPM1、FLT3基因突變在AML患者中的發(fā)生率增高，而ASXL1、U2AF1基因突變率減低；在60歲以上患者中，NPM1、FLT3、DNMT3A和IDH2基因突變在AML患者中的發(fā)生率增高。可以看出，隨著年齡的變化，甲基化相關(guān)基因的發(fā)生率發(fā)生了較顯著的變化。一項含有11 262例受訪者的研究[19]表明，隨著年齡的增長克隆性造血的發(fā)生率亦增加，其中DNMT3A、TET2、ASXL1突變最常見。這些結(jié)果表明甲基化相關(guān)基因異常在老齡AML和MDS的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。

總之，利用二代測序技術(shù)綜合比較MDS和AML兩種疾病分子生物學(xué)的差異，將來再結(jié)合臨床治療、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后資料的歸納分析，有益于MDS和AML的精準診斷、危險分層及預(yù)后判斷，并有助于理解兩種疾病分子發(fā)病機制的異同。