佟 堯,吳紫薇,陳 娟,劉 驥,唐俊妮

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041)

枇杷為薔薇科常綠喬木果樹(shù),其果實(shí)是枇杷栽培生產(chǎn)和消費(fèi)者食用的主要經(jīng)濟(jì)器官,我國(guó)產(chǎn)量大約占世界枇杷總產(chǎn)量的70%[1]。枇杷果肉含有人體所必需的多種營(yíng)養(yǎng)成分,是一類(lèi)營(yíng)養(yǎng)豐富具有保健功能的果品,并且具有很高的藥用價(jià)值[2-4]。雪梨被稱為“百果之宗”,果實(shí)飽滿、香脆多汁,含有糖類(lèi)、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)元素及有機(jī)酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上認(rèn)為雪梨性味清涼甘甜,入肺,有生津、潤(rùn)燥、清熱、化痰、保肝、促食欲、助消化、清潔腸道等功效[5-6]。目前,關(guān)于枇杷的研究大多是針對(duì)枇杷葉和果實(shí)的提取物及其功能[7],如枇杷葉中提取的多糖可改善大鼠腎小球損傷[8],枇杷葉提取物對(duì)卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥也有抑制作用[9],枇杷果實(shí)提取物則可通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、炎癥等預(yù)防非酒精性脂肪肝[10]。關(guān)于雪梨的研究主要是用于制作功能性飲料等[6,11-12],也有學(xué)者提取雪梨多糖運(yùn)用在卷煙上[13]?？梢?jiàn),這兩種水果均對(duì)人體健康有很大的益處。

自20世紀(jì)以來(lái),人們對(duì)果酒的興趣日益濃厚[14-15]。有多種多樣的果酒被研發(fā)出來(lái),如Tsegay等[16]研制了仙人掌果實(shí)發(fā)酵酒并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化;Qi等[17]研制了菠蘿果酒并進(jìn)行評(píng)價(jià)。雪梨和枇杷是常見(jiàn)的食補(bǔ)搭檔,關(guān)于雪梨枇杷復(fù)合發(fā)酵酒產(chǎn)品在市場(chǎng)上尚不多見(jiàn)。現(xiàn)有的研究更多的是單一發(fā)酵果酒,如劉紅云等[18]以枇杷為原料釀制枇杷果酒,牛黎莉等[19]以皇冠梨為原料釀制梨果酒。只有少許雪梨和其他種類(lèi)水果的復(fù)合果酒研制,如譚新佳等[20]研制了涼薯雪梨果酒,李瀟等[21]以葡萄和雪梨為原料研制了葡萄雪梨復(fù)合果酒。隨著消費(fèi)意識(shí)的提高,消費(fèi)者逐漸開(kāi)始青睞更加健康綠色、口感更加符合大眾要求的果酒飲料。

我國(guó)枇杷和雪梨品資源豐富,開(kāi)發(fā)雪梨枇杷復(fù)合果酒,具有廣泛的市場(chǎng)前景。因此,本文以雪梨和枇杷這兩種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的水果為原料,研究果酒發(fā)酵工藝,并采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)復(fù)合果酒的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,研制出一種符合現(xiàn)代人需求的復(fù)合果酒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雪梨 四川省廣元市;枇杷 四川省德昌縣;安琪葡萄酒果酒專用酵母SY 湖北省宜昌市安琪酵母股份有限公司;偏重亞硫酸鉀 拉曼德工廠;果膠酶(12000 U/g) 寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司;無(wú)水檸檬酸 濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司;白砂糖 成都市新紀(jì)元食品有限公司;其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

JS30-230多功能攪拌機(jī) 蘇泊爾股份有限公司;PYX-DHS·400-BS-Ⅱ型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;SC-15數(shù)控超級(jí)恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司;PHS-3C酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司;果酒酒精度計(jì)(0～25%vol) 河北省勝啟儀表廠;2WAY阿貝折射儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司;UV-6100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;Thermos氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(配置Triplus進(jìn)樣系統(tǒng)) 美國(guó)Thermos公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 果酒制備工藝流程與操作要點(diǎn)

1.2.1.1 果酒制作工藝流程

1.2.1.2 果酒制備操作要點(diǎn) 將采購(gòu)的雪梨和枇杷剔除病果爛果,清洗后去皮去核,分別破碎打漿,按照雪梨與枇杷為6∶4的比例混合雪梨原漿與枇杷原漿后,立即加入偏重亞硫酸鉀使SO2的添加量為80 mg/L并混合,加入添加量為40 mg/L的果膠酶后,混合均勻并置于40 ℃水浴中酶解2 h;使用白砂糖液將混合漿的糖度調(diào)節(jié)至23 °Brix,用檸檬酸調(diào)節(jié)混合漿pH為3.4～3.6;按照0.4 g/L的添加量將酵母加入白砂糖含量為5%的糖液中,在38 ℃下活化30 min,冷卻至28 ℃后加入至混合漿中,混合均勻后在28 ℃下進(jìn)行主發(fā)酵5 d,分離果渣后,獲得雪梨枇杷發(fā)酵原酒,進(jìn)行感官評(píng)價(jià)、理化性質(zhì)分析以及微生物分析。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 采用均分法確定每個(gè)因素最佳合適量。

1.2.2.1 雪梨與枇杷漿體積比確定 分別將雪梨漿和枇杷漿的比例調(diào)至3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3,加入添加量為80 mg/L的SO2,使初始糖度為23 °Brix,調(diào)節(jié)pH為3.5,加入0.4 g/L的酵母發(fā)酵5 d,分離果渣后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)及理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2.2 酵母接種量確定 將雪梨漿與枇杷漿比例為6∶4的復(fù)合漿,使SO2的添加量為80 mg/L,調(diào)整初始糖度為23 °Brix,pH調(diào)節(jié)至3.5,分別加入接種量為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的酵母進(jìn)行5 d的主發(fā)酵,分離果渣后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)及理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2.3 SO2添加量確定 將雪梨漿與枇杷漿比例為6∶4,使SO2添加量為60、80、100、120、140 mg/L,調(diào)節(jié)初始糖度為23 °Brix,pH調(diào)整至3.5,加入接種量為0.4 g/L的酵母,進(jìn)行5 d的主發(fā)酵,分離果渣后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)及理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2.4 初始pH確定 雪梨漿和枇杷漿的比例為6∶4,加入80 mg/L的SO2,初始糖度為23 °Brix,調(diào)整pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5,加入接種量為0.4 g/L的酵母,進(jìn)行5 d的主發(fā)酵,分離果渣后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)及理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),感官評(píng)價(jià)得分為評(píng)分指標(biāo),將雪梨與枇杷體積比、酵母接種量、SO2添加量和初始pH采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)法來(lái)確定,試驗(yàn)因子與水平表見(jiàn)表1。

表1 雪梨枇杷復(fù)合果酒主發(fā)酵工藝的正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for themain fermentation of snow pear loquat compound wine

1.2.4 感官評(píng)價(jià)、理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)分析測(cè)定方法

1.2.4.1 感官評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定 由10人組成評(píng)定小組,要求具有一定食品感官評(píng)價(jià)知識(shí)基礎(chǔ),依照表2為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表2 雪梨枇杷復(fù)合果酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The sensory evaluation criteria for snow pear loquat compound fruit wine

1.2.4.2 理化指標(biāo)的測(cè)定 酒精度測(cè)定:酒精度計(jì);pH測(cè)定:pH酸度計(jì);還原糖測(cè)定:斐林法[22];糖度測(cè)定:阿貝折射儀;總酸測(cè)定:酸堿滴定法[22];透光率的測(cè)定[23]:分光光度法,以蒸餾水作為空白,在680 nm波長(zhǎng)處用1 cm比色杯測(cè)定透光率T%來(lái)反映酒的澄清度;色度測(cè)定[24]:分光光度法。

1.2.4.3 微生物指標(biāo)的測(cè)定 菌群總數(shù)測(cè)定[25]及大腸菌群測(cè)定[26]。

1.2.5 雪梨枇杷復(fù)合果酒揮發(fā)性成分的測(cè)定

1.2.5.1 雪梨枇杷復(fù)合果酒的前處理 取5 mL雪梨枇杷復(fù)合果酒樣于20 mL萃取瓶,加入1 g NaCl促進(jìn)揮發(fā)性成分揮發(fā),加蓋密封,采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入萃取瓶,在80 ℃條件下預(yù)孵化30 min,萃取10 min。

1.2.5.2 GC-MS氣相色譜分析 TR-FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);分流模式,分流比為20∶1;流速1 mL/min;升溫程序:40 ℃保持3 min,以7 ℃/min升溫至220 ℃并保持2 min;載氣為99.999%氦氣;進(jìn)樣口溫度230 ℃;解吸時(shí)間2 min[27]。

質(zhì)譜分析條件:電子電離源,電子能量70 eV;離子源溫度250 ℃;傳輸線溫度220 ℃;全掃描模式,質(zhì)量掃描范圍30～550 amu。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,將檢測(cè)出的化合物的結(jié)構(gòu)特征與圖譜進(jìn)行比對(duì)。采用面積歸一化法定量,確定雪梨枇杷果酒里的揮發(fā)性成分含量。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0和Excel處理數(shù)據(jù)并繪制曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 雪梨與枇杷漿體積比對(duì)果酒發(fā)酵的影響 雪梨與枇杷漿體積比影響發(fā)酵果酒的口感和色澤,從表3可以看出,雪梨比重增加時(shí),透光率也隨之上升,果酒酒體清澈透亮。結(jié)合圖1和表3可以看出,當(dāng)梨與枇杷的比例為6∶4時(shí),在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)酒精度達(dá)到9%vol,其透光率為最高,為92.60%;感官評(píng)價(jià)中,雪梨與枇杷體積比為6∶4的果酒較好地中和了雪梨與枇杷的味道,既有梨的清香,又有枇杷的甘甜,酸甜適中,無(wú)苦澀口感,其色澤呈淡橘黃色,色澤明亮,因此選擇雪梨枇杷體積比為6∶4。

圖1 不同雪梨枇杷體積比對(duì)酒精度的影響Fig.1 Effect of different snow pearand loquat volume ratio on alcohol degree

表3 不同雪梨枇杷體積比下果酒品質(zhì)的比較Table 3 Comparison of the fruit wines quality with different ratios of snow pear and loquat

2.1.2 不同酵母接種量對(duì)果酒發(fā)酵的影響 酵母接種量過(guò)高時(shí),會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵速度過(guò)快,果酒風(fēng)味變差,接種量過(guò)低,會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期[28]。結(jié)合圖2和表4可以看出,當(dāng)接種量為0.2 g/L時(shí),發(fā)酵速度緩慢,酒精度低,在感官評(píng)價(jià)中果味重于酒味。當(dāng)接種量等于1.0 g/L,在發(fā)酵過(guò)程中,前期發(fā)酵速度明顯快于其它接種量,發(fā)酵液中糖被消耗掉,最后發(fā)酵結(jié)束時(shí),酒精度偏低。在接種量為0.6、0.8 g/L的時(shí)候,雖然酒精度較高,但在感官評(píng)定中酒體呈現(xiàn)黃棕色,口感發(fā)澀、發(fā)苦。當(dāng)接種量為0.4 g/L時(shí),發(fā)酵程度適中,呈現(xiàn)良好的理化指標(biāo),透光率高達(dá)91.70%,酒體清澈透亮,純正柔和,顏色為雪梨枇杷果酒應(yīng)有的淡黃色澤,口感爽口。因此接種量選擇為0.4 g/L。

表4 不同酵母接種量下果酒品質(zhì)的比較Table 4 Comparison of fruit wine quality with different proportion of yeast inoculation amounts

圖2 不同酵母接種量下酒精度的變化Fig.2 Effects of yeast inoculationamounts on alcohol degree

2.1.3 不同SO2添加量對(duì)果酒發(fā)酵的影響 SO2能抑制酒體中微生物生長(zhǎng),SO2添加量低,對(duì)微生物的抑制能力弱,易導(dǎo)致酒體被污染,SO2添加量高,降低或抑制酵母菌的生長(zhǎng),無(wú)法發(fā)酵完全。由表5可知,當(dāng)SO2添加量大于80 mg/L時(shí),酒精度與透光率降低,糖度升高,說(shuō)明此時(shí)SO2的含量過(guò)高,已經(jīng)導(dǎo)致酵母細(xì)胞的活性降低。由圖3可知,當(dāng)SO2添加量為80 mg/L時(shí),發(fā)酵程度高,到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí),酒精度明顯高于其他添加量。添加量為80 mg/L時(shí),抑制了其它不利于發(fā)酵的微生物生長(zhǎng)的同時(shí),給予酵母細(xì)胞一個(gè)良好的生長(zhǎng)環(huán)境,此時(shí)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較為活躍,酒體發(fā)酵效果好。因此,SO2添加量選擇為80 mg/L。

表5 不同SO2添加量下果酒品質(zhì)的比較Table 5 Comparison of wine quality with different SO2 addition amounts

圖3 不同SO2添加量下酒精度的變化Fig.3 Effect of SO2 addition amounts on alcohol degree

2.1.4 初始pH不同對(duì)果酒發(fā)酵的影響 初始pH的不同會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞表面帶電狀態(tài)不同[29],影響酵母細(xì)胞的新陳代謝和發(fā)酵效率[28],進(jìn)而影響果酒的品質(zhì)。從圖4可知,隨著pH上升,酒精度也在上升,在pH為4.0時(shí)到達(dá)最高點(diǎn),其余初始pH在發(fā)酵過(guò)程中酒精度變化波動(dòng)大,折線圖增長(zhǎng)時(shí)快時(shí)慢,不平穩(wěn)。在感官評(píng)價(jià)中,pH越低,口感越酸澀,甜味越淡。結(jié)合圖4和表6可知,當(dāng)pH為4.0時(shí),發(fā)酵過(guò)程平穩(wěn),易于控制,酒味較為濃郁,有明顯的果香,酸甜適宜,更符合對(duì)于果酒的感官要求。因此,pH選擇為4.0。

表6 不同初始pH下果酒品質(zhì)的比較Table 6 Comparison of wine quality different proportion of initial pH value

圖4 不同初始pH下酒精度的變化Fig.4 Effects of initial pH value on alcohol degree

2.2 主發(fā)酵工藝參數(shù)的正交優(yōu)化

由表7可知,各因素對(duì)雪梨枇杷復(fù)合果酒的影響大小為D>C>B>A,即初始pH>酵母接種量>雪梨枇杷體積比>SO2添加量,說(shuō)明初始pH是影響雪梨枇杷復(fù)合果酒的重要因素,綜合各因素下雪梨枇杷復(fù)合果酒的品質(zhì)性狀,并結(jié)合感官評(píng)價(jià)指標(biāo)確定雪梨枇杷復(fù)合果酒的最佳工藝組合為A2B2C2D1,即SO2的添加量為80 mg/L,雪梨枇杷體積比為6∶4,酵母接種量為0.4 g/L,初始pH為3.5。在相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)A2B2C2D1組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)為91分。

表7 雪梨枇杷復(fù)合果酒主發(fā)酵工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 The orthogonal experiment results of the mainfermentation process with snow pear loquat compound fruit wine

2.3 雪梨枇杷復(fù)合果酒理化性質(zhì)

參照正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的最佳工藝組合條件,進(jìn)行4組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),5 d發(fā)酵結(jié)束后,最終得到果酒總酸平均值含量為7.60 g/L(以醋酸計(jì)算),剩余還原糖量平均值為8.32 g/L,pH平均值為3.56,透光率平均值為91.5%,酒精度平均值為9.51%vol,顏色強(qiáng)度為1.464。

2.4 雪梨枇杷復(fù)合果酒微生物指標(biāo)檢測(cè)

從表8中可知,雪梨枇杷復(fù)合果酒的菌群總數(shù)為11 CFU/mL。大腸菌群檢測(cè)中,所有稀釋度VRBA平板均無(wú)菌落生長(zhǎng),按標(biāo)準(zhǔn)要求,以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算,因此雪梨枇杷復(fù)合果酒中大腸菌群小于10-9MPN/mL,以上微生物檢測(cè)指標(biāo)均符合NY/T 1508-2017《綠色食品果酒標(biāo)準(zhǔn)》[30]。

表8 雪梨枇杷復(fù)合果酒微生物指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 8 The detection results of microbial indicatorsfor snow pear loquat compound fruit wine

2.5 雪梨枇杷復(fù)合果酒揮發(fā)性化合物結(jié)果與分析

經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化過(guò)工藝參數(shù)的雪梨枇杷復(fù)合果酒揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖見(jiàn)圖5,鑒定出的主要揮發(fā)性成分以及部分揮發(fā)性成分見(jiàn)表9。

表9 雪梨枇杷復(fù)合果酒中揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 9 Analysis results of volatile flavor components in snow pear loquat compound wine

圖5 雪梨枇杷復(fù)合果酒揮發(fā)性成分GC-MS總離子圖Fig.5 CG/MS total ion current of volatile flavorcompounds ofsnow pear loquat compound wine

經(jīng)GC-MS分析,綜合圖5和表9,雪梨枇杷復(fù)合果酒中能檢測(cè)到有保留時(shí)間和峰面積的揮發(fā)性成分中SI(相似度指數(shù))≥40的有30種,占總檢出揮發(fā)性成分的92.18%。從表9中可以看出,其中酸類(lèi)物質(zhì)5種(3.77%),酯類(lèi)物質(zhì)15種(16.51%),醇類(lèi)物質(zhì)7種(71.31%),其他化合物3種(0.59%)。相對(duì)含量較大的有8種,分別為乙醇(57.35%)、異戊醇(8.95%)、癸酸乙酯(7.47%)、月桂酸乙酯(3.70%)、苯乙醇(3.37%)、辛酸乙酯(2.14%)、正癸酸(2.02%)、2-甲基-1-丙醇(1.17%),占雪梨枇杷復(fù)合果酒中總揮發(fā)性成分總量的86.17%。

梨果肉中的主要揮發(fā)性成分為醇類(lèi)[31],枇杷果肉中的主要揮發(fā)性成分為醛類(lèi)[32],與其相比,雪梨枇杷復(fù)合果酒中含量較高的揮發(fā)性成分為醇類(lèi)和酯類(lèi),共占總揮發(fā)性成分的87.82%。發(fā)酵過(guò)程對(duì)酒體產(chǎn)生了影響,醇類(lèi)和酯類(lèi)對(duì)酒體的香味起著積極的作用。高級(jí)醇是酒精飲料中一類(lèi)重要的揮發(fā)性香氣物質(zhì)[33]。在本實(shí)驗(yàn)雪梨枇杷復(fù)合果酒酒體中,高級(jí)醇有苯乙醇、異戊醇等醇類(lèi)物質(zhì),其中苯乙醇帶有玫瑰香氣,而異戊醇可使酒體醇厚并具有回甜口感。酒體還含有具有香蕉氣味的乙酸異戊酯、水果香味的正己酸乙酯和辛酸3-甲基丁酯、椰子香氣的癸酸乙酯等酯類(lèi)物質(zhì),使果酒具有美好的水果香氣。

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),得出雪梨枇杷復(fù)合果酒在主發(fā)酵中,各因素對(duì)果酒酒精度影響次序?yàn)?初始pH>酵母接種量>雪梨枇杷體積比>SO2添加量,最佳工藝組合條件為雪梨枇杷體積比為6∶4,發(fā)酵原漿的初始pH為3.5,SO2的添加量為80 mg/L,酵母的接種量為0.4 g/L。此時(shí),果酒總酸含量為7.60 g/L(以醋酸計(jì)算),剩余還原糖量為8.32 g/L,pH為3.56,透光率為91.5%,酒精度為9.51%vol。

經(jīng)過(guò)頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合GC-MS技術(shù)分析雪梨枇杷復(fù)合果酒中揮發(fā)性成分,發(fā)現(xiàn)與主要揮發(fā)性成分為醇類(lèi)的梨果肉[29]和主要揮發(fā)性成分為醛類(lèi)的枇杷果肉[30]相比,雪梨枇杷復(fù)合果酒中含量最高的揮發(fā)性成分為醇類(lèi)和酯類(lèi),一共占總揮發(fā)性成分的87.82%,該研究將為雪梨枇杷復(fù)合果酒的實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用提供科學(xué)性的理論支持。