盧杰 閆洪波 范利偉

摘 ? 要：試驗以小球藻為材料，探討不同處理條件對超低溫冷凍后成活效果的影響，以獲得最優(yōu)保存方法，重點針對微藻時期、預(yù)處理中的蔗糖濃度、玻璃化液中DMSO的濃度等方面的影響展開試驗。結(jié)果表明，小球藻群體密度中等（OD680為0.800～1.100）的小球藻，0.5 mol/L甘油和0.4 mo1/L蔗糖的預(yù)處理液，30%蔗糖+15%乙二醇+5%二甲基亞砜+BG-11液體培養(yǎng)基的玻璃化液處理可以達到最高成活率，從而確定了小球藻的最適超低溫保存條件。

關(guān)鍵詞：微藻;超低溫保存;玻璃化液;研究

常用的藻種保藏方法多為在液體培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，但此方法具有易污染、保藏時間短、操作煩瑣費力和工作量大等缺點，而且多次傳代培養(yǎng)還易造成藻種退化。自從英國科學(xué)家C.Polge等學(xué)者在1949年首次用甘油作冷凍保護劑，并用超低溫冷凍保存的方法將動物精子保存成功后，超低溫冷凍保存方法開始廣泛應(yīng)用于動、植物的種質(zhì)保存[1]。由于超低溫冷凍保存法具有快捷、細胞成活率高并且所需設(shè)備簡便、投資少等特點， 目前已在部分動物和高等植物中進行了深入研究，針對國內(nèi)藻類的超低溫冷凍保存的報道較少，試驗以來源于石家莊辛集的微藻（Chlorella sorokiniana）為材料研究冷凍保存中的關(guān)鍵因素，建立了與之相適應(yīng)的超低溫保存體系。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料

微藻藻種Chlorella sorokiniana（Shihira & R.W.Krauss）來源于石家莊市廢水。

1.2 ? 微藻超低溫保存處理方法

（1）在溫度為25 ℃、光照強度為4 000 lx的培養(yǎng)箱中使用BG-11培養(yǎng)基在三角瓶中進行微藻培養(yǎng)，每天定時搖動，保證微藻正常生長。

（2）通過用分光光度計連續(xù)測定微藻溶液的吸光度來確定微藻的生長程度，選取不同生長程度的微藻進行同樣的超低溫處理，研究微藻生長狀態(tài)對超低溫處理效果的影響。

（3）用12 000轉(zhuǎn)離心后收集微藻細胞，微藻細胞用含有0.5 mol/L甘油和不同濃度蔗糖的預(yù)處理液，于室溫下處理微藻20 min。

（4）預(yù)處理后離心收集微藻細胞，置于4 ℃冰箱中預(yù)冷的含有不同DMSO濃度的玻璃化液（30%蔗糖+15%乙二醇+不同濃度DMSO+BG-11液體培養(yǎng)液），并進行脫水處理，1 h后在冰上更換新鮮的預(yù)冷玻璃化液，然后用紗布把EP管包住、用棉繩纏住快速放入液氮中，處理時間為90 min。

⑸液氮冷凍處理結(jié)束后，采取40 ℃恒溫水浴快速解凍法解凍。離心收集微藻細胞后，先加入0.4 mo1/L的蔗糖溶液在室溫平衡5 min，洗滌，棄上清，接著再加入1.2 mo1/L的蔗糖溶液于室溫平衡5 min[2]，進行第2次洗滌，最后轉(zhuǎn)入BG-11液體培養(yǎng)基進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后測定成活率。

⑹參照 Canavat及Lubian[3]方法，用分光光度計于波680 nm處測藻液的吸光度，與之對照的百分比值即為經(jīng)過超低溫冷凍保存后的藻細胞成活率[4]。

上述試驗重復(fù)3次，每次試驗設(shè)置3個平行樣品，最終取其平均值。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 不同生長時期的微藻對成活率的影響

由表1得知不同生長時期的微藻對成活率的影響為：隨著微藻細胞濃度增大，冷凍處理后其成活率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當680 nm吸光度值從0.649升高到0.982之間，成活率逐漸升高，并且在0.879～0.982之時成活率相差不是很大，達到了55%以上，但是在細胞濃度進一步升高超過0.982之后其成活率逐漸降低，成活率最低僅有19.33%。王起華等人認為抗凍性和藻類細胞年齡對成活率的影響與藻類種類有關(guān)[5]，試驗結(jié)果進一步驗證了這一個判斷。Piasecki等人在[6]研究細胞密度對衣藻冷凍成活率的影響時得到的成活率趨勢跟本試驗完全一致。相對來說選擇OD680在0.800～1.100時成活率較高。

2.2 ? 預(yù)處理液中不同蔗糖濃度對成活率的影響

如圖1所示，沒有經(jīng)過高糖培養(yǎng)基預(yù)處理的藻細胞成活率較低，僅為32.37%，隨著蔗糖濃度的升高成活率逐漸升高，蔗糖濃度在0.4 mol/L時成活率最高。蔗糖濃度在0.5 mol/L以上時，隨著蔗糖濃度的升高微藻成活率呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢，當蔗糖濃度達到0.9 mol/ L時，成活率僅19.14% ，這是由于過高的蔗糖濃度形成滲透脅迫對藻細胞造成傷害，導(dǎo)致藻細胞受損，影響其成活率，因此以0.5 mol/L甘油和0.4 mol/L蔗糖的組合最佳，成活率可達到58.35%。在冷凍前對材料進行預(yù)處理能增強細胞的抗凍能力，常用的預(yù)處理液主要包括高濃度的蔗糖，有些研究中還在高濃度的蔗糖中加入甘油等其他保護劑[7，8]。與試驗結(jié)果一致，表明合適的蔗糖濃度可以提高成活率。

2.3 ? 玻璃化液中不同DMSO濃度對成活率的影響

B.J.Finkle等認為，DMSO、甘油、PEG是超低溫保存植物材料的常用保護劑，且三者混合使用效果更好[9]。但是防凍劑本身對微藻也有一定的毒性，隨著濃度的變化，毒性效果和保護效果也會有所變化。閆立強等[10]發(fā)現(xiàn)，DMSO對兩種藍藻的毒性與DMSO濃度有關(guān)。試驗結(jié)果如表2所示，5%二甲基亞砜處理的微藻成活率最高。由此得知，高濃度的DMSO對微藻的毒害作用很大，但是低濃度的DMSO可以作為微藻的超低溫冷凍保護劑，同時低濃度的玻璃化液起到了一定的保護作用，而且對藻的毒性也小。

綜上所述，小球藻的生長時期、預(yù)處理液中不同的蔗糖濃度，以及玻璃化液中不同DMSO濃度都對小球藻的超低溫冷凍成活率有著明顯的影響。選用藻時，既要求達到一定的密度，也要求其生長活性較好，當680 nm吸光值為0.854時，用含有0.5 mol/L甘油和0.4 mo1/L蔗糖的預(yù)處理液，及30%蔗糖+15%乙二醇+5%二甲基亞砜+BG-11液體培養(yǎng)基的玻璃化液連續(xù)處理后，其超低溫處理效果最好，從而確定這個條件是最好的小球藻超低溫保存條件。