李敏晶 姚珊珊 劉遠(yuǎn)

摘要 [目的]采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化砂海星皂苷的提取工藝。[方法]在單因素試驗條件下探討乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間4個因素對砂海星皂苷提取率的影響，并得到各因素的最佳試驗條件，然后使用Design Expert 8.056軟件建立二次響應(yīng)面回歸模型，利用響應(yīng)面法分析砂海星皂苷提取的最佳提取工藝條件。[結(jié)果]砂海星皂苷的最佳提取工藝條件為乙醇濃度79%、提取時間2.8 h、提取溫度89 ℃、料液比為1∶27（g∶mL），在此試驗條件下，砂海星皂苷的提取率為8.04%。[結(jié)論]該研究為砂海星資源的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 響應(yīng)面法;砂海星;皂苷;提取工藝

Abstract [Objective] The research aimed to optimize the extraction process of saponins from Luidia quinaria by response surface analysis.[Method] Single factor experiments were conducted to investigate the effects of ethanol concentration， solidliquid ratio， extraction temperature and extraction time on the extraction ratio of saponins from Luidia quinaria， and the optimum experiment conditions of each factor were obtained. Then， a quadratic response surface regression model was established by using Design Expert 8.056 software. Response surface method was used to analyze the optimal extraction conditions of saponins.[Result]The optimal extraction conditions of saponins were as follows： ethanol concentration was 79%， extraction time was 2.8 h， extraction temperature was 89 ℃， and solidliquid ratio was 1∶27. Under this condition， the extraction ratio of saponin was 8.04%.[Conclusion] This research provides theoretical basis for the further development of Luidia quinaria resources.

Key words Response surface method;Luidia quinaria von martens;Saponin;Extraction process

砂海星屬于棘皮動物門（Echinodermata）海星綱（Asteroidea）瓣棘總目（Valvatacea）顯帶目（Paxillosida）砂海星科（Luidiidae Verrill），廣泛分布于黃渤海、東海、南海及臺灣海域[1]。動物界所含皂苷只存在于海洋的棘皮動物門，而海星的所有組織中都含有皂苷，且海星皂苷具有重要的生理活性和多樣的藥理活性。海星中的皂苷根據(jù)它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)主要可以分為硫酸酯甾體皂苷、環(huán)狀甾體皂苷和多羥基甾體皂苷3種類型[2]。海星皂苷最早的報道出現(xiàn)于20世紀(jì)60年代，是由日本學(xué)者Hashimoto發(fā)表的。Hashimoto等[3]研究發(fā)現(xiàn)海星皂苷的苷元與海參皂苷元骨架不同，因此為其命名為海星皂苷（asterosaponins）。國外關(guān)于海星皂苷的結(jié)構(gòu)、活性、藥理等方面的研究報道較多。Dubois等[4-5]從海星Asterina pectinifera中發(fā)現(xiàn)并鑒定了6種皂苷化合物，且這些皂苷對L120和KB腫瘤細(xì)胞具有抑制活性;Iorizzi等[6]從海星Echinasteridae中分離得到7種海星皂苷、13種多羥基甾體皂苷，并測定了這些皂苷化合物對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制活性;Findlay等[7]從海星Asterias forbesi中分離得到了海星皂苷Forbeside A-H，并驗證其降血壓作用;De等[8]從南極海盤車科海星中分離得到5種海星皂苷其對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有較強的抑制活性;到目前為止，已從海星綱3個主要目（瓣海星目、樁海星目、鉗棘目）14個科的60多種具代表性的海星中分離獲得近400多種甾體化合物，對于海星皂苷的研究正在逐步深入。通過大量的文獻(xiàn)證明海星的藥用資源豐富，我國大部分海域都有分布，其研究與開發(fā)的潛力巨大。筆者采用響應(yīng)面分析法對砂海星皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為砂海星資源的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

砂海星，采自黃海海域，經(jīng)鑒定為砂海星（Luidia quinariavon Martens.）;皂苷標(biāo)準(zhǔn)樣品由大連海洋大學(xué)實驗室提供;無水乙醇、濃硫酸、香草醛等試驗試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-752型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;BSA224S型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;THZ-82電熱恒溫水浴鍋，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司;101G-1B電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海實驗儀器總廠;SY2-4離心機，北京醫(yī)用離心機廠;SHB-Ⅲ循環(huán)水真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RHP-600型高速多功能粉碎機，浙江榮浩工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

取0.5 mL梯度濃度海星皂苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入0.5 mL 8%的香草醛，在冰浴中加入5 mL 72%的濃硫酸，充分搖勻，放入62 ℃的恒溫水浴中，保溫20 min。取出后置于冰浴中冷卻，再搖勻，在544 nm處測量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 皂苷的提取。

將砂海星干燥粉碎，過20目篩，得到砂海星粗粉。精確稱取1.0 g砂海星粗粉，置于60 mL回流裝置中，設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)條件以考察不同工藝下皂苷的提取率。將提取液在4 000 r/min離心10 min，取上清液按“1.3.1”的方法測定提取液中的皂苷含量。

1.3.3 單因素試驗。

對乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間4個影響皂苷提取效果的參數(shù)進(jìn)行單因素試驗，分別考察乙醇濃度60%、70%、80%、90%、100%;料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL）;提取溫度30、40、50、60、70、80、90、100 ℃;提取時間1、2、3、4、5、6 h等不同提取條件對皂苷提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計4因素3水平Box-Benhnken模型試驗[9-10]，把砂海星皂苷的提取率作為響應(yīng)值（Y），把“1.3.3”中的4個因素作為自變量，按照表1設(shè)計試驗因素及水平分別進(jìn)行試驗。使用Design Expert 8.056軟件進(jìn)行響應(yīng)面的設(shè)計和結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對砂海星皂苷提取率的影響。

由圖1可知，乙醇濃度在60%～80%時，砂海星皂苷提取率隨乙醇濃度的增加而增加，在乙醇濃度為80%時達(dá)到最大，此時提取率為2.02%;乙醇濃度大于80%時，砂海星皂苷提取率逐漸下降，可能與皂苷的結(jié)構(gòu)和極性相關(guān)。因此，選擇最佳乙醇濃度為80%。

2.1.2 料液比對砂海星皂苷提取率的影響。

由圖2可知，砂海星皂苷提取率隨料液比增加呈先緩慢增加后顯著增加的趨勢，達(dá)到最高后又開始下降，當(dāng)料液比在1∶10～1∶25，皂苷的提取率與料液比呈正相關(guān)，最大提取率出現(xiàn)在1∶25時，說明此時固體與液體接觸面積在當(dāng)前試驗條件下已達(dá)到最大，為2.14%。當(dāng)料液比在1∶25～1∶35皂苷含量不斷下降，此時可能有更多雜質(zhì)溶出。因此，選擇最佳料液比為1∶25。

2.1.3 提取溫度對砂海星皂苷提取率的影響。

由圖3可知，提取溫度在30～50 ℃時，砂海星皂苷提取率增加并不顯著;50～ 80 ℃時，隨溫度增加，砂海星皂苷提取率增加速度較快，當(dāng)達(dá)到80 ℃時分子熱運動相對劇烈，增加了皂苷分子的溶出，此時提取率達(dá)到最大，為4.56%，隨后，溫度再增加，砂海星皂苷提取率逐漸下降。分析其原因是在溫度較高的條件下，皂苷結(jié)構(gòu)被破壞。因此，選擇最佳提取溫度為80 ℃。

2.1.4 提取時間對砂海星皂苷提取率的影響。

由圖4可知，提取時間在1～3 h時，砂海星皂苷提取率隨提取時間增大而增大，在提取時間為3 h時，提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增加提取時間，砂海星皂苷的提取率反而會降低。分析原因是提取時間過長會使其皂苷成分不再繼續(xù)被溶出反而發(fā)生副反應(yīng)使分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，同時隨著提取時間的增加，雜質(zhì)溶出量也會增多。因此，選擇最佳提取時間為3 h。

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 試驗設(shè)計方案及結(jié)果。

以單因素試驗結(jié)果確定了乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間4個影響因素的設(shè)計水平，以Design-Expert 8.056 軟件進(jìn)行Box-Benhnken響應(yīng)面試驗設(shè)計，試驗結(jié)果如表2所示。

2.2.2 回歸模型分析。

根據(jù)表2的試驗設(shè)計進(jìn)行回歸擬合，建立皂苷提取率（Y）與乙醇濃度（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）、料液比（D）之間的回歸模型，擬合后以編碼因子表示的方程為：

2.2.3 響應(yīng)面中各因素對砂海星皂苷提取率的影響。

利用Design-Expert 8.056 軟件做不同因素間響應(yīng)面分析圖與等高線圖，結(jié)果如圖 5 所示。

3 結(jié)論

采用單因素控制變量法，研究了乙醇濃度、提取時間、提取溫度和料液比對砂海星皂苷提取率的影響，單因素試驗結(jié)果顯示，乙醇的最佳濃度為80%，提取時間3 h最好，提取溫度80 ℃效果最好，料液比1∶25最佳;并根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定了各因素的水平設(shè)置。利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了砂海星皂苷的提取工藝，結(jié)果表明，這些影響因素中提取溫度和料液比最顯著，其次是提取時間，乙醇濃度的影響最不顯著。同時在進(jìn)行砂海星皂苷提取時，還要考慮溫度和料液比之間的相互影響。由響應(yīng)面法得出最佳提取工藝條件為乙醇濃度79%、提取時間2.8 h、提取溫度89 ℃、料液比1∶27，此時的砂海星皂苷提取率為8.04%，此法適用于優(yōu)化砂海星皂苷的提取工藝。今后可進(jìn)一步將皂苷進(jìn)行柱層析分離純化及活性測定，為砂海星資源的進(jìn)一步開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉偉，廖玉麟，李新正.中國海砂海星科（棘皮動物門，海星綱）種類記述[J].動物分類學(xué)報，2007，32（1）：234-240.

[2] 劉洋，趙杰，邵長倫，等.藍(lán)指海星Linckia laevigata中次級代謝產(chǎn)物及其生物活性研究進(jìn)展[J].中國海洋藥物，2011，30（6）：52-58.

[3] HASHIMOTO Y，YASUMOTO T.Confirmation of saponin as a toxic principle of starfish[J].Bull Japanese Soci Soc Sci Fish，1960，26（11）：1132-1138.

[4] DUBOIS M A，NOGUCHI Y，HIGUCHI R，et al.Biologically active glycosides from asteroidea，XIV.Steroid oligoglycosides from the starfish Asterina pectinifera Müller et Troschel，2 structrures of two new oligoglycoside sulfates：Pectinioside C and pectinioside D[J].Liebig Ann Chem，1988，6：495-500.

[5] DUBOIS M A，HIGUCHI R，KOMORI T，et al.Biologically active glycosides from Asteroidea，XVI.Steroid oligoglycosides from the starfish Asterina pectinifera Muller et Troschel，3 structrures of two new oligoglycoside sulfates：Pectinioside E and F， and biological activities of the six new pectinioside F[J].Liebig Ann Chem，1988，9：845-850.

[6] IORIZZI M，DE MARINO S，MINALE L，et al.Investigation of the polar steroids from an Antarctic Starfish of the family Echinasteridae：Isolation of twenty seven polyhydroxysteroids and steroidal oligoglyeosides，structures and biological activities[J].Tetrahedron，1996，52（33）：10997-11012.

[7] FINDLAY J A，HE Z Q，BLACKWELL B.Minor saponins from the starfish Asteriasforbesi[J].Can J Chem，1990，68（7）：1215-1217.

[8] DE MARINO S，IORIZZI M，ZOLLO F，et al.Isolation，structure elucidation，and biological activity of the steroid oligoglycosides and polyhydroxysteroids from the antarctic starfish Acodontaster conspicuous[J].J Nat Prod，1997，60（10）：959-966.

[9] 范煜，王鑫寧，張強，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化竹葉蛋白質(zhì)提取工藝[J].竹子學(xué)報，2018，37（3）：37-44.

[10] 王珊，郭曉蒙，馬挺軍.響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥芽皂苷提取工藝研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2018，41（6）：80-86.