郭濤， 紀(jì)冬梅， 李艷平， 盧陽， 弋莉， 王曉紅

（朝陽市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，遼寧朝陽 122000）

急性T 淋巴細(xì)胞白血?。═-acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）是一種起源于T細(xì)胞祖細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，占兒科病例的15%，占成人病例的25%[1]。在大多數(shù)兒童白血病患者中化療非常有效，且隨著對T細(xì)胞生物學(xué)理解的不斷加深，目前兒童的5 年存活率可達(dá)到65%～70%，而成人患者僅30%～50%[2-3]。T-ALL的治療方法包括單藥化療、分子靶向治療、造血干細(xì)胞移植和細(xì)胞免疫治療等，由于供體骨髓來源限制、費(fèi)用高、并發(fā)癥嚴(yán)重，目前仍以化療為主要策略[4]。因此，增強(qiáng)治療效果、改善預(yù)后是T-ALL 治療亟待解決的問題，同時探索新的、更有效的藥物或治療策略也是十分重要的醫(yī)學(xué)內(nèi)容。我國傳統(tǒng)名貴中藥金釵石斛是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，具有益胃生津、滋陰清熱、延年益壽的功效。石斛堿（dendrobine）是一種倍半萜類生物堿，是金釵石斛的主要有效成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)證明，其有抗高血壓、抗癌、鎮(zhèn)痛和解熱等作用[5-11]?；诖?，本研究以體外培養(yǎng)的人皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤HuT-78細(xì)胞為研究對象，探討石斛堿對白血病細(xì)胞體外存活和轉(zhuǎn)移特性的影響，以期為T-ALL 的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng)人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤HuT-78細(xì)胞株來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），以含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%以上時進(jìn)行消化傳代。

1. 2 藥物石斛堿（純度≥98%，貨號：2115-91-5），分子式：C16H25NO2，購自武漢天植生物技術(shù)有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）配制成濃度為1 mg/mL母液，使用時用細(xì)胞培養(yǎng)基作相應(yīng)稀釋。

1. 3 試劑RPMI 1640、胎牛血清、2.5 g/L 胰酶購自美國Gibco 公司； 細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（CCK8）（用于細(xì)胞增殖及毒性檢測）、Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒、結(jié)晶紫染色液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Matrigel 購自美國Invitriogen 公司；Transwell 小室購自北京優(yōu)尼康生物技術(shù)有限公司；RIPA 裂解液購自南京碧云天生物技術(shù)公司；兔源Ki67、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3（cl-caspase-3）、cleaved caspase-9（cl-caspase-9）、細(xì)胞色素C（CC）、 E-鈣粘附素（E-cadherin）、N-鈣粘附素（N-cadherin）、Snail、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）、p38、磷酸化p38（p-p38）、β-actin 單/多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Abcam公司。

1.4 儀器CO2培養(yǎng)箱（美國ThermoForma 公司）；電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀（美國伯樂公司）；Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（廣州云星儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州中亞凈化設(shè)備有限公司）；普通光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 CCK8實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞存活率 將HuT-78細(xì)胞接種于96 孔板，待細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為9 個石斛堿濃度（0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/mL）組，每組設(shè)6 個復(fù)孔。每組分別給予對應(yīng)濃度的石斛堿處理24 h 后，每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測定各孔的吸光度（D）值。細(xì)胞存活率（%）=（D藥物- D空白）/（D對照- D空白）×100%。D藥物：含藥孔D 值；D空白：不含細(xì)胞和藥物孔D 值；D對照：含細(xì)胞不含藥物孔D 值。根據(jù)細(xì)胞存活率結(jié)果選擇石斛堿無明顯細(xì)胞毒性（大于80%）的3 個濃度（1、2.5、5 μg/mL）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞增殖能力 接種細(xì)胞于6孔板內(nèi)，每孔1×106個細(xì)胞，待細(xì)胞融合率達(dá)80%，分組后分別加入對應(yīng)濃度的藥物處理24 h。收集各組細(xì)胞，每組取1 000 個細(xì)胞接種到6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)10 d。用體積分?jǐn)?shù)20%乙醇固定克隆，0.4%結(jié)晶紫染色。鏡下觀察并計算各組克隆數(shù)。

1.5.3 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率 接種細(xì)胞于6 孔板內(nèi)，每孔1 × 106個細(xì)胞，待細(xì)胞融合率達(dá)80%時，分組后加入對應(yīng)終濃度藥物處理24 h。收集細(xì)胞，調(diào)整密度至1×106個/mL。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，取100 μL 加入5 μL 的Annexin VFITC 和10 μL 的PI 染色液，室溫避光孵育15 min后，上機(jī)檢測。

1.5.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞侵襲遷移能力 將HuT-78 細(xì)胞接種于提前用Matrigel 基質(zhì)膠包被好的Transwell 小室上層，細(xì)胞密度為1 × 105個/mL，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，Transwell 小室下層則加入正常細(xì)胞培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，用無菌棉簽拭去Matrigel 基質(zhì)膠和小室上層細(xì)胞，后用4%多聚甲醛固定小室，再用0.1%結(jié)晶紫染色細(xì)胞，流水沖洗去除多余染料并晾干。顯微鏡下每組隨機(jī)選取5個視野，對染色細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每組6個復(fù)孔。

1. 5. 5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測Ki67、Bcl-2、Bax、cl-caspase-3、cl-caspase-9、CC、E-cadherin、N-cadherin、Snail、MMP-2、MMP-9、JNK、p38表達(dá)水平 將HuT-78細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分組加入不同濃度石斛堿，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞。用RIPA 蛋白裂解液于冰上裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，4 ℃離心收集上清，用BCA 試劑盒定量蛋白。取等量蛋白質(zhì)用12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白后，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF 膜。用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉蛋白質(zhì)2 h，分別加入稀釋度為1∶200的一抗（Ki67、Bcl-2、Bax、cl-caspase-3、cl-caspase - 9、 CC、 E-cadherin、 N - cadherin、Snail、MMP-2、MMP-9、JNK、p38），4 ℃孵育過夜。棄去一抗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。滴加ECL 于暗室曝光顯影。以β-actin 為內(nèi)參，通過凝膠成像儀分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度計算其相對蛋白表達(dá)水平（p）。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 石斛堿抑制體外培養(yǎng)HuT-78 細(xì)胞的增殖CCK8 法測定不同濃度石斛堿處理后HuT-78 細(xì)胞的存活率，結(jié)果顯示：隨著石斛堿處理濃度的增加，HuT-78 細(xì)胞存活率逐漸降低，且濃度大于5 μg/mL時細(xì)胞存活率低于80%，并存在統(tǒng)計學(xué)差異（P ＜0.05 或P ＜0.01），見圖1-A。故選擇無明顯細(xì)胞毒性的1、2.5和5 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察石斛堿對HuT-78細(xì)胞體外增殖能力的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，石斛堿劑量依賴性地抑制HuT-78細(xì)胞的克隆形成數(shù)量和增殖蛋白Ki67 表達(dá)水平（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖1-B，-C。

圖1 石斛堿對HuT-78細(xì)胞增殖能力的影響Figure 1 Effects of DEN on proliferation of HuT-78 cells

2.2 石斛堿促進(jìn)體外培養(yǎng)HuT-78細(xì)胞的凋亡流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot實(shí)驗(yàn)觀察石斛堿對HuT-78細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，石斛堿劑量依賴性地增加HuT-78 細(xì)胞的凋亡率，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平，上調(diào)促凋亡蛋白Bax、cl-caspase-3、cl-caspase-9、CC 表達(dá)水平（P ＜0.05或P ＜0.01）。見圖2-A，-B。

2.3 石斛堿抑制體外培養(yǎng)HuT-78 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化Transwell 實(shí)驗(yàn)和Western Blot 實(shí)驗(yàn)觀察石斛堿對HuT-78細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，石斛堿劑量依賴性地減少HuT-78 細(xì)胞侵襲數(shù)量，下調(diào)間充質(zhì)標(biāo)記蛋白Ncadherin、Snail、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平，上調(diào)上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin 表達(dá)水平（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖3-A，-B。

2.4 石斛堿促進(jìn)體外培養(yǎng)HuT-78 細(xì)胞JNK、p38磷酸化表達(dá)Western Blot實(shí)驗(yàn)觀察石斛堿對HuT-78細(xì)胞JNK、p38磷酸化的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，石斛堿劑量依賴性地增加p-JNK/JNK、p-p38/p38蛋白表達(dá)水平（P ＜0.05）。見圖4。

2.5 石斛堿逆轉(zhuǎn)JNK抑制劑SP600125對增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Ki67、MMP-2、clcaspase-3、p-JNK/JNK 表達(dá)的影響Western Blot實(shí)驗(yàn)觀察石斛堿和/或SP600125 對細(xì)胞Ki67、MMP-2、cl-caspase-3、p-JNK/JNK 表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，石斛堿組細(xì)胞低表達(dá)Ki67、MMP-2蛋白，高表達(dá)cl-caspase-3、p-JNK/JNK 蛋白（P ＜0.05）；SP600125 組細(xì)胞則高表達(dá)Ki67、MMP-2蛋白，低表達(dá)cl-caspase-3、p-JNK/JNK 蛋白（P ＜0.05）；與SP600125單獨(dú)處理組比較，石斛堿和SP600125 共同處理組細(xì)胞Ki67、MMP-2 蛋白表達(dá)降低，cl-caspase-3、p-JNK/JNK蛋白表達(dá)增加（P ＜0.05）。見圖5。

3 討論

圖2 石斛堿對HuT-78細(xì)胞凋亡率的影響Figure 2 Effects of DEN on apoptotic rate of HuT-78 cells

正常情況下，T 細(xì)胞發(fā)育受到系統(tǒng)性嚴(yán)格調(diào)控，是造血祖細(xì)胞遷移到胸腺分化為功能多樣的T淋巴細(xì)胞亞群的過程[12]。在此過程中，致癌基因的異常激活和抑癌基因表達(dá)降低或缺失均能導(dǎo)致胸腺前體不受控制的克隆擴(kuò)張，進(jìn)而導(dǎo)致T-ALL 發(fā)生[13]。因此，抑制T 淋巴細(xì)胞不正常分化是治療T-ALL 的關(guān)鍵。Ki67 是一種增殖細(xì)胞核抗原，與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤標(biāo)記物之一[14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)石斛堿能抑制體外培養(yǎng)的HuT-78細(xì)胞增殖能力及增殖關(guān)鍵蛋白Ki67的表達(dá)水平，且當(dāng)濃度大于5 μg/mL時可對細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)石斛堿除在一定濃度范圍內(nèi)劑量依賴性地抑制人HuT-78細(xì)胞增殖外，還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并調(diào)節(jié)凋亡關(guān)鍵蛋白的表達(dá)（下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，上調(diào)促凋亡蛋白Bax、cl-caspase-3、cl-caspase-9和CC）。細(xì)胞凋亡是機(jī)體生理和病理過程中均存在的細(xì)胞程序性死亡形式，而細(xì)胞凋亡抵抗是腫瘤發(fā)展進(jìn)程的特點(diǎn)之一。在正常條件下，Bcl-2能夠與Bax形成異源二聚體，維持膜電位阻止CC釋放。當(dāng)細(xì)胞受到各種異常刺激后，Bax 表達(dá)升高，Bax 自身形成同源二聚體從而拮抗Bcl-2 對膜電位的維持作用，CC 從線粒體中釋放并與pro-caspase-9形成凋亡體激活caspase-9，進(jìn)而激活下游級聯(lián)caspase-3，從而引起細(xì)胞凋亡，這是經(jīng)典的線粒體依賴的凋亡通路[15]。本研究結(jié)果表明石斛堿促腫瘤細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制可能是通過此通路實(shí)現(xiàn)的，但仍不排除非線粒體依賴的凋亡通路參與其中。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化易于侵襲轉(zhuǎn)移，在癌癥的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。Ecadherin是一種重要的細(xì)胞粘附因子，其表達(dá)下調(diào)或缺失，伴隨著N-cadherin 的表達(dá)上調(diào)，通過與β-catenin 連接形成復(fù)合物維持上皮細(xì)胞穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用。Snail 結(jié)合到E-cadherin的啟動子上可抑制其基因轉(zhuǎn)錄，從而參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[16-17]。另外，Khalil 等[18]報道，MMP-2和MMP-9 可作為腫瘤侵襲和遷移特性的標(biāo)記物，其表達(dá)水平可解釋腫瘤侵襲性高低。本研究結(jié)果表明，石斛堿可劑量依賴性地抑制Hut-78 細(xì)胞的侵襲遷移，同時降低N-cadherin、Snail、MMP-2和MMP-9 蛋白表達(dá)，增加E-cadherin 蛋白表達(dá)，進(jìn)而有效維持細(xì)胞間的粘附，降低細(xì)胞極性丟失，從而降低HuT-78細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)展進(jìn)程。

圖3 石斛堿對HuT-78細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Figure 3 Effects of DEN on epithelial mesenchymal transition of HuT-78 cells

圖4 石斛堿對HuT-78細(xì)胞JNK、p38磷酸化表達(dá)的影響Figure 4 Effects of DEN on phosphorylation of JNK and p38 in HuT-78 cells

圖5 石斛堿和/或SP600125對HuT-78細(xì)胞Ki67、cl-caspase-3、MMP-2、p-JNK/JNK表達(dá)水平的影響Figure 5 Effects of DEN and/or SP600125 on expression levels of Ki67，cl-caspase-3，MMP-2，p-JNK/JNK in HuT-78 cells

JNK 是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的一個重要分支，在細(xì)胞周期、凋亡和應(yīng)激等生理和病理過程中起著重要作用。JNK信號通路被上游信號激活后，胞質(zhì)中的JNK 移位到細(xì)胞核，進(jìn)一步使核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子c-Jun 氨基末端63/73 位的絲氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而啟動線粒體依賴的細(xì)胞凋亡[19-20]。p38 與JNK 性質(zhì)相似，同屬于應(yīng)激激活的蛋白激酶。研究表明，JNK/p38參與了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控過程，Zhu等[21]發(fā)現(xiàn)，通過激活MAPK/JNK/p38信號通路，人卵巢癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力受到明顯抑制。那么，石斛堿對人HuT-78細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移的抑制作用是否與JNK 信號通路激活相關(guān)？本研究結(jié)果表明，石斛堿能激活JNK 信號通路，且能部分抵消JNK 抑制劑的干預(yù)作用，從而實(shí)現(xiàn)對人HuT-78細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用。但石斛堿對人HuT-78細(xì)胞的作用是否還有其他信號通路的參與，還有待深入研究。

綜上所述，本研究以HuT-78 細(xì)胞為研究對象，探討石斛堿對白血病細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制。結(jié)果表明，石斛堿可能通過增加JNK 信號通路磷酸化活化水平，實(shí)現(xiàn)抑制白血病細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移特性的作用。