(山西運(yùn)城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 運(yùn)城 044000)

獨(dú)葉草(KingdoniaunifloraBalf.F.et W.W.Smith)隸屬于毛茛科(Ranunculaceae)獨(dú)葉草屬(KingdoniaunifloraBalf. F. et W. W. Smith)，是我國特有的珍稀瀕危單種屬多年生草本植物，自然分布于云南、四川、陜西以及甘肅等4省的局部區(qū)域[1]。該植物進(jìn)化地位原始，生境特殊，分布區(qū)狹小，已被列為我國的一級重點(diǎn)保護(hù)植物和生物多樣性的關(guān)鍵類群[2-3]。目前，關(guān)于獨(dú)葉草的研究主要集中在種群的分布[4-6]、種群生態(tài)[7-8]、繁育生物學(xué)[9-11]、組織培養(yǎng)[12]等方面；在遺傳多樣性和遺傳關(guān)系方面的研究也有一定的報(bào)道[13-14]，但相對于其他植物則較為滯后。因此，進(jìn)一步研究獨(dú)葉草的遺傳多樣性，有助于科學(xué)評估該植物的遺傳背景，為后續(xù)的保護(hù)、研究、開發(fā)與利用提供可能的理論基礎(chǔ)。

目前，研究植物遺傳多樣性和居群結(jié)構(gòu)最常用的檢測方法是采用DNA分子標(biāo)記技術(shù)[15]。諸如SSR[16]、ISSR[17]、SCoT[18]。SCoT(start codon targeted polymorphism，目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性標(biāo)記)具有操作簡單、引物通用性強(qiáng)、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。該標(biāo)記已成功應(yīng)用于粉枝莓[19]、枸杞[20]、五角楓[21]、辣木[22]、彩葉芋[23]等植物種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究，但不同植物的最佳SCoT-PCR反應(yīng)體系存在較大的差異[18]。SCoT標(biāo)記在獨(dú)葉草方面的應(yīng)用尚未見報(bào)道。因此，以獨(dú)葉草為供試材料，建立并優(yōu)化其SCoT-PCR反應(yīng)體系，初步篩選SCoT引物，旨在為獨(dú)葉草種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究提供理論基礎(chǔ)。

表1 SCoT引物的序列

序號引物序列1CAACAATGGCTACCACCG2ACCATGGCTACCACCGAC3CAACAATGGCTACCACGA4CAACAATGGCTACCACGC5CAACAATGGCTACCACCT6CAACAATGGCTACCACGT7CAACAATGGCTACCAGCA8AACCATGGCTACCACCAC9AAGCAATGGCTACCACCA10ACGACATGGCGACCAACG11ACGACATGGCGACCATCG12ACGACATGGCGACCGCGA13ACCATGGCTACCACCGAG14ACCATGGCTACCACCGGC15ACGACATGGCGACCCACA16CAACAATGGCTACCACCA序號引物序列17CACCATGGCTACCACCAG18ACCATGGCTACCACCGGG19ACCATGGCTACCACCGCC20ACCATGGCTACCACCGTG21CCATGGCTACCACCGCCA22CCATGGCTACCACCGGCC23CCATGGCTACCACCGGCG24CCATGGCTACCACCGCAC25CAACAATGGCTACCACCC26CAACAATGGCTACCACGG27CAACAATGGCTACCAGCC28ACGACATGGCGACCACGC29ACCATGGCTACCACCGCG30CACCATGGCTACCACCAT31CCATGGCTACCACCGCCT32ACCATGGCTACCACCGTC

表2 SCoT-PCR反應(yīng)體系的因素和水平

水平Mg2+(25mmol·L-1)/μLdNTPs(2.5mmol·L-1)/μLTaq酶(5U·μL-1)/μLPrimer(10μmol·L-1)/μLDNA(10ng)/μL11.50.500.10.4122.01.000.20.8232.51.500.31.2343.02.000.41.64

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料采自于陜西省太白山(107°77′E；33°96′N)。選取長勢好的植株，采集無病蟲害的新鮮葉片而迅速放入硅膠干燥劑中保存，做好相應(yīng)的標(biāo)記。采集完畢后，迅速將材料帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過液氮冷凍后，放入-80 ℃的超低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。SCoT 標(biāo)記引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。10×Buffer、dNTPs 及TaqDNA 聚合酶等PCR試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1基因組DNA的提取與檢測

獨(dú)葉草的基因組DNA提取采用改良的CTAB法[14]。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所得的樣品基因組DNA質(zhì)量。同時(shí)，用可見光分光光度計(jì)(ND-1000 Spectrophotometer)檢測樣品DNA的濃度。將樣品的濃度稀釋至10 ng·μL-1，保存于-80 ℃的超低溫冰箱中備用。

1.2.2獨(dú)葉草SCoT-PCR體系的正交設(shè)計(jì)

根據(jù)正交設(shè)計(jì)表，對SCoT-PCR反應(yīng)體系的各個(gè)因子(dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶、Primer和模板DNA等5個(gè)因子)的濃度進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)因子有4個(gè)水平，共5個(gè)因子(表2)。根據(jù)正交表，選擇L16(45)處理，即總共16個(gè)處理組合(表3)。SCoT-PCR反應(yīng)體系總共為20μL， 10×Buffer都是2.0μL。PCR反應(yīng)程序參照張若晨等[21]的方法，擴(kuò)增結(jié)果在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測，凝膠成像系統(tǒng)攝像并保存。

1.2.3獨(dú)葉草SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

隨機(jī)選取多條引物，以所有的樣品為對象，對優(yōu)化而得的獨(dú)葉草SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系驗(yàn)證。SCoT-PCR反應(yīng)程序和電泳檢測同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取與檢測

影響PCR擴(kuò)增的因素比較多，基因組DNA是其中之一?；蚪MDNA的濃度和完整性都會對擴(kuò)增效果有影響。因此，在實(shí)驗(yàn)前，都對基因組DNA的完整性和濃度進(jìn)行檢測。由樣品基因組DNA的電泳結(jié)果看出(圖1)，每個(gè)加樣孔均沒有雜質(zhì)殘留，電泳條帶整齊而略有拖尾，除了第7號樣品的亮度較弱、第10號較亮以外，其余樣品條帶的亮度適中。這初步表明所得的基因組DNA無蛋白質(zhì)和RNA的污染，其質(zhì)量和濃度可以滿足PCR實(shí)驗(yàn)的需要。同時(shí)，用可見光分光光度計(jì)(ND-1000 Spectrophotometer)檢測樣品DNA的濃度，并根據(jù)檢測結(jié)果，將樣品的濃度濃縮或稀釋至10 ng·μL-1，保存于-80 ℃的超低溫冰箱中備用。

表3 SCoT-PCR反應(yīng)體系的L16(45)正交設(shè)計(jì)表

處理組合Mg2+dNTPsTaq酶PrimerDNA1111112122223133334144445212346221437234128243219313421032431113312412342131341423144231415432411644132

圖1 部分樣品基因組DNA的電泳結(jié)果

圖2 獨(dú)葉草SCoT-PCR體系優(yōu)化的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

通過正交試驗(yàn)，得出獨(dú)葉草SCoT-PCR體系優(yōu)化的擴(kuò)增結(jié)果(圖2)。根據(jù)圖2的電泳結(jié)果可以看出，在16個(gè)組合中，除了4號和12號未能擴(kuò)增出結(jié)果以外，剩下的14個(gè)組合都能擴(kuò)增出大小不一、數(shù)量不同、亮度迥異、效果不一的條帶。條帶的大小介于200～2 000 bp之間。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，1、8組合的條帶清晰度低，而且數(shù)量較少；2、7、11、14、16組合的條帶相對較為清晰，但集中在1 000～2 000 bp之間；9、10、13組合的條帶則相對模糊；3、5、6、15組合的電泳效果最好，不僅條帶數(shù)量豐富，而且主條帶清晰而明顯，分散性好而亮度適中。通過綜合比較3、5、6、15組合電泳條帶的豐富性、大小、亮度等，初步認(rèn)為組合3最優(yōu)。

2.3 正交試驗(yàn)的直觀分析

根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，可以主觀地對每一個(gè)組合的電泳效果進(jìn)行評分。電泳條帶數(shù)量豐富、大小合適、清晰度高、分散性好、亮度適中的最優(yōu)組合記為16，最差組合則記為1分[18]。同時(shí)，基于主觀評分結(jié)果，計(jì)算出各因素的極差值(R值)。R值的大小與該因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的程度成正比。根據(jù)直觀分析表的R值(表4)可以得知，在各個(gè)因子中，對獨(dú)葉草SCoT-PCR反應(yīng)體系影響最大的是dNTPs和引物，二者的極差值均為7.25；其次是鎂離子，再次是TaqDNA聚合酶；影響最小的是基因組DNA。

進(jìn)一步對各因子的每個(gè)水平的主觀評分(表4)，各因子的最適加樣量為：Mg2+為2.0μL或3.0μL、dNTPs為1.50μL、Taq酶為0.2μL、Primer為1.2μL、DNA為3.0μL。L16(45)正交設(shè)計(jì)表卻沒有與之完全吻合的處理，只是和組合3的相近。該組合的各因子最適加樣量：Mg2+為1.5μL、dNTPs為1.50μL、Taq酶為0.3μL、Primer為1.2μL、DNA為3.0μL。兩者在Mg2+和Taq酶的用量上有差異，但這2個(gè)因子對體系的影響力均排在dNTPs和Taq酶后面；單因子最適加樣量：Mg2+為2.0μL或3.0μL，Taq酶為0.2μL；而組合3最適加樣量：Mg2+為1.5μL，Taq酶為0.3μL。同時(shí)，曲線效應(yīng)圖(圖3)表明，Mg2+隨著加樣量的增加，效應(yīng)曲線呈現(xiàn)Z字型，但加樣量為1.5μL時(shí)的效果，與單因子最優(yōu)加樣量的差異不大；而dNTPs、Taq酶、Primer和DNA等4個(gè)因子的效應(yīng)曲線均隨著加樣量的增加而呈先增后減的趨勢。因此，確定珍稀瀕危植物獨(dú)葉草SCoT-PCR最佳反應(yīng)組合為第3組合，即總體積25μL：Mg2+為1.5μL、dNTPs為1.50μL、Taq酶為0.3μL、Primer為1.2μL、DNA為3.0μL。

表4 正交設(shè)計(jì)直觀分析

結(jié)果Mg2+dNTPsTaq DNA聚合酶引物DNAk17.256.259.504.506.00k29.758.509.755.758.25k33.7511.506.7511.89.25k49.754.254.508.507.00R6.007.255.257.253.25

2.4 獨(dú)葉草SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

反應(yīng)體系的穩(wěn)定性影響到后續(xù)實(shí)驗(yàn)。因此，對優(yōu)化的體系進(jìn)行驗(yàn)證有其必要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)表明：在優(yōu)化而得的體系中，36份獨(dú)葉草樣品均能擴(kuò)增出數(shù)量不同、清晰適中、分散性好的條帶，而且條帶的多態(tài)性豐富。擴(kuò)增條帶數(shù)大多為2～4條，片段大小大多介于750～2 000 bp之間。這表明，試驗(yàn)所建立的獨(dú)葉草SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系的效果好、穩(wěn)定性高，可用于后續(xù)的種質(zhì)資源遺傳多樣性評價(jià)，親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)等方面的研究。

圖4 最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

3 討 論

獨(dú)葉草生境特殊，分布區(qū)狹小，已被列為我國的一級重點(diǎn)保護(hù)植物；而且進(jìn)化地位原始，對研究被子植物的進(jìn)化和毛茛科的系統(tǒng)發(fā)育具有重要的科學(xué)意義[24]。該植物在遺傳多樣性和遺傳關(guān)系方面的研究相對于其他植物則較為滯后，而基于SCoT標(biāo)記的相關(guān)研究也未見報(bào)道。SCoT標(biāo)記的引物通用性強(qiáng)，但是不同材料的最佳體系則有一定的差異。彩葉芋等[23]的SCoT標(biāo)記最佳反應(yīng)體系為(20μL)：引物濃度0.7μmol·L-1，dNTPs濃度0.5 mmol·L-1，TaqDNA 聚合酶1.25 U，DNA 模板80 ng，Mg2+濃度1.5 mmol·L-1；而粉枝莓[19]的則為(20μL)：引物濃度1.0μmol·L-1，dNTPs濃度0.125 mmol·L-1，TaqDNA 聚合酶0.15μL，DNA 模板40 ng，Mg2+濃度1.5 mmol·L-1。

同時(shí)，各個(gè)因素對反應(yīng)體系的影響大小也因材料的不同而有差異。研究表明：獨(dú)葉草SCoT-PCR反應(yīng)體系各因子的影響大小為：dNTPs =引物>Mg2+>TaqDNA聚合酶> 模板DNA。彩葉芋等[23]的SCoT-PCR反應(yīng)體系中，dNTPs影響最大，接下來依次為Mg2+、模板DNA、Taq酶和引物濃度；而辣木[22]的PCR反應(yīng)中各個(gè)因素對反應(yīng)體系的影響程度為dNTP>Mg2+>Taq>引物>DNA 濃度。通過綜合直觀分析、電泳圖等結(jié)果，建立了珍稀瀕危植物獨(dú)葉草的SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系，即第3組合(25μL)：Mg2+為1.5μL、dNTPs為1.50μL、Taq酶為0.3μL、Primer為1.2μL、DNA為3.0μL。為后續(xù)獨(dú)葉草種質(zhì)資源遺傳多樣性的評價(jià)、親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)的研究等方面提供了技術(shù)支持。