劉昱彤

摘?要：BCCIP是一個(gè)與BRCA2和p21相互作用的蛋白質(zhì)，在眾多細(xì)胞進(jìn)程中具有重要作用。p53是一種重要的腫瘤抑制基因，也是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。本文通過引入P53基因來研究BCCIP抑制腫瘤的生物學(xué)功能，驗(yàn)證BCCIP與P53之間的蛋白相互作用關(guān)系。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄調(diào)控;BCCIP;P53;抑癌基因;蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用;表觀遺傳學(xué)

BCCIP是一個(gè)與BRCA2和p21相互作用的蛋白質(zhì)。作為一種新近克隆成功的抑癌基因，BCCIP是細(xì)胞生存、基因穩(wěn)定不可缺少的基因，該蛋白在胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞有絲分裂、DNA同源重組（HR）以及保持基因組穩(wěn)定性等眾多細(xì)胞進(jìn)程中都具有重要作用[1]。截至到目前的研究，在Bio GRID數(shù)據(jù)庫記錄的BCCIP相互作用蛋白有50多種，功能涉及多種細(xì)胞生物學(xué)過程，預(yù)示著BCCIP蛋白在更多方面的功能還有待進(jìn)一步研究。有研究表明，BCCIP基因在乳腺癌、腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、喉癌、肺癌、黑色素瘤、腎癌、前列腺癌等組織中的表達(dá)量均有降低或不表達(dá)[2]，提示BCCIP與這些腫瘤的發(fā)生相關(guān)，也進(jìn)一步證實(shí)了BCCIP可能為一個(gè)重要的抑癌基因。

為了進(jìn)一步探討B(tài)CCIP的功能和作用機(jī)制，我們將研究BCCIP與P53之間相互作用的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)域以揭示BCCIP在腫瘤中發(fā)揮的功能。因此，我們引入P53基因來研究BCCIP抑制腫瘤的生物學(xué)功能。已有研究證實(shí)，BCCIP通過調(diào)節(jié)p53的轉(zhuǎn)錄活性，減少p53四聚體的形成，阻止p53與它的靶基因p21和HDM2的增強(qiáng)子結(jié)合。目前P53對(duì)P21的調(diào)控作用已有充分的研究，我們將著重研究BCCIP對(duì)P53的調(diào)控作用。在前期數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步闡明BCCIP與P53之間的蛋白相互作用位點(diǎn)，本文擬設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建BCCIP的真核和原核的表達(dá)載體，通過Co-IP和GST pull down等技術(shù)找出BCCIP與P53相結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)域。

1 材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要化學(xué)試劑

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回DNA收試劑盒、丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）、D2000 plus DNA ladder、DL500 DNA marker、預(yù)染蛋白Marker SM0671、胎牛血清。

1.1.2 常用試劑成分

（1）LB液體培養(yǎng)基（1L）：10g NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，調(diào)pH至7.4，高壓蒸汽滅菌。

（2）LB固體培養(yǎng)基（1L）：LB液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉。

（3）SOC培養(yǎng)基（1L）：20g胰蛋白胨，5g酵母提取物，2ml 5M NaCl，2.5ml 1M KCl，10ml 1M MgCl2，10ml 1M MgSO4，20ml 1M葡萄糖。

（4）Amp抗生素：1克Amp，10ml蒸餾水，濃度100mg/ml。

（5）DMEM培養(yǎng)基（1L）：一包粉末DMEM培養(yǎng)基，800ml水，2g NaHCO3，10%血清。

（6）磷酸緩沖體系（PBS）（1L）：NaCl 137mmol/L，KCl 27mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L。用濃鹽酸調(diào)pH為7.4。

（7）胰酶：0.25g胰酶，100mlPBS，調(diào)PH為7.4。

（8）50×TAE buffer（1L）：Tris 242g，冰乙酸57.1ml，0.5mol/L EDTA（pH 8.0）100ml。

（9）6×loading buffer（DNA電泳）：30mM EDTA，36%（V/V）甘油。

（10）10×濕轉(zhuǎn)transfer buffer（1L）：Tris 14.4g、甘氨酸3.02g、甲醇100ml。

（11）4×SDS-PAGE Loading Buffer（1L）：量取1M Tris-HCl 10ml，稱取4g SDS，200mgBPB，20ml甘油。

（12）PBS（1L）：1ml雙抗+999ml PBS。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

低溫保存箱、藥品保存箱、-80℃冰箱、-40℃冰箱、PCR儀、恒溫臥式搖床、紫外分光光度計(jì)、超聲破碎儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀電源、水平電泳槽、迷你離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、垂直混合器、低速離心機(jī)、可見光分析燈箱、恒溫培養(yǎng)箱、雙垂直蛋白電泳儀、臺(tái)式離心機(jī)、電子天平、渦旋混勻器、瓊脂糖凝膠電泳儀、洗片機(jī)、超純水機(jī)、制冰機(jī)、磁力攪拌器、脫色搖床。

2 實(shí)驗(yàn)思路與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)研究思路

首先我們根據(jù)BCCIP和P53的蛋白結(jié)構(gòu)域特征，分別構(gòu)建了BCCIP和P53的不同截短真核表達(dá)質(zhì)粒，然后在HCT116細(xì)胞中共轉(zhuǎn)BCCIP和P53的不同截短質(zhì)粒，通過COIP實(shí)驗(yàn)和免疫印跡檢測技術(shù)，確定BCCIP與P53相互作用的具體結(jié)構(gòu)域。而后在HCT116細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)一定量的P53全長表達(dá)質(zhì)粒和梯度劑量的BCCIP全長表達(dá)質(zhì)粒，通過Western blot檢測BCCIP對(duì)P53蛋白的穩(wěn)定性的影響;再用同樣的方法瞬轉(zhuǎn)不同的截短表達(dá)質(zhì)粒，檢測BCCIP對(duì)P53相互作用結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性影響，進(jìn)而揭示BCCIP對(duì)P53的調(diào)控以及在癌癥中的生物學(xué)功能。

2.2 實(shí)驗(yàn)研究方法

2.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

（1）設(shè)計(jì)BCCIP和P53的截短質(zhì)粒引物，PCR選擇最佳退火溫度。（2）DNA電泳并做膠回收。（3）目的片段連接T載體。（4）大腸桿菌轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選，挑菌。（5）PCR檢測，選擇電泳條帶正確的菌株進(jìn)行小提。（6）送公司進(jìn)行測序。（7）將連T的Insert和載體分別進(jìn)行大切膠回收（先小切進(jìn)行驗(yàn)證）。（8）Insert與Vector連接。（9）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，挑菌。（10）菌液PCR選取條帶位置正確的菌液進(jìn)行小提。（11）送公司進(jìn)行測序。

2.2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒Co-IP實(shí)驗(yàn)

（1）在HCT116細(xì)胞中共轉(zhuǎn)BCCIP和P53的表達(dá)質(zhì)粒。（2）瞬轉(zhuǎn)48小時(shí)后收細(xì)胞，RIPA裂解液4度裂解6小時(shí)。（3）12000rpm，4度，離心1小時(shí)，收集裂解后上清。（4）平衡beads，beads與細(xì)胞裂解液孵育過夜進(jìn)行結(jié)合。（5）洗脫非特異蛋白，做樣，western blot檢測。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在細(xì)胞周期調(diào)控中，目前發(fā)現(xiàn)BCCIP通過3個(gè)途徑調(diào)節(jié)p21蛋白;在同源重組修復(fù)中，BCCIP除了通過BRCA2-RAD51蛋白通路外，還可能通過p21蛋白參與細(xì)胞周期和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)節(jié)進(jìn)而影響同源重組修復(fù)[3];在維持基因組穩(wěn)定性方面，BCCIP下調(diào)引起細(xì)胞分裂中期染色體斷裂和姐妹染色單體交聯(lián)，從而影響細(xì)胞的有絲分裂，抑制細(xì)胞的增值。

One等[4]發(fā)現(xiàn)BCCIPα的161-259氨基酸區(qū)域與p21的C端149～164氨基酸和CDK2結(jié)合后形成三聚體。BCCIPα的過表達(dá)通過增強(qiáng)p21抑制CDK2組蛋白H1激酶活性的能力以達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的目的。Meng等[5]發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)BCCIPβ與p21相互作用可以抑制細(xì)胞的生長，并且p21蛋白下調(diào)的細(xì)胞阻斷部分其抑制細(xì)胞生長的功能。用RNA干擾技術(shù)抑制BCCIP基因表達(dá)可引起p21蛋白水平下調(diào)，并且使HT1080細(xì)胞G1/S周期檢查點(diǎn)對(duì)電離輻射應(yīng)答的功能受損。而過表達(dá)BCCIPα或BCCIPβ引起p21mRNA水平和蛋白表達(dá)的升高，延遲細(xì)胞的G1/S期。而增加p21蛋白的穩(wěn)定性并不會(huì)引起B(yǎng)CCIP過表達(dá)對(duì)P21的影響。p21是p53下游的靶基因，p53是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基腫瘤抑制基因。在所有惡性腫瘤中，該基因有一半以上的概率發(fā)生突變。研究者推測p53可能與BCCIP對(duì)p21的調(diào)節(jié)相關(guān)，接下來的研究發(fā)現(xiàn)沉默p53基因表達(dá)后，BCCIP過表達(dá)不再引起p21水平升高，說明p53是BCCIP誘導(dǎo)p21表達(dá)的關(guān)鍵因素[6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BCCIP對(duì)p53的轉(zhuǎn)錄活性起著關(guān)鍵的作用，在p53野生型細(xì)胞，p53蛋白水平不會(huì)因BCCIP蛋白的下調(diào)而變化，但是會(huì)引起p53轉(zhuǎn)錄活性的降低，減少p53四聚體的形成，阻止p53與它的靶基因p21和HDM2的增強(qiáng)子結(jié)合[7]。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)BCCIP和P53的蛋白結(jié)構(gòu)域特征，分別構(gòu)建了BCCIP和P53的不同截短真核表達(dá)質(zhì)粒;先用帶GFP熒光質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)以測其瞬轉(zhuǎn)效率，證明其瞬轉(zhuǎn)效率沒有問題，然后在HCT116細(xì)胞中，通過瞬轉(zhuǎn)本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的質(zhì)粒。我們檢測到質(zhì)粒在HCT116細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)均表達(dá)，構(gòu)建成功;再通過CO-IP實(shí)驗(yàn)和免疫印跡檢測技術(shù)，驗(yàn)證了BCCIP與P53之間的蛋白相互作用關(guān)系，進(jìn)一步論證了BCCIP蛋白會(huì)影響DNA損傷的重組修復(fù)，G1/S細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞有絲分裂和基因組穩(wěn)定性，這些都說明BCCIP與腫瘤的發(fā)生和腫瘤的治療有著密不可分的關(guān)系。

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基金：吉林大學(xué)2019年省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201910183791）