高俊珍 劉艷芳 王立紅 付秀華 徐磊 顧巖

隨著人們生活方式的不斷改變以及生活環(huán)境的逐漸惡化，肺癌的發(fā)病率及病死率正呈逐年升高趨勢，且在所有惡性腫瘤中位居首位，嚴(yán)重威脅人類的生命健康安全[1]。本世紀(jì)初表皮生長因子受體(EGFR)首次被發(fā)現(xiàn)，并在2008年被證實(shí)EGFR突變屬于肺腺癌驅(qū)動因子，從而使得表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)作為一線治療肺腺癌的方案開始進(jìn)入人們視野[2]。隨著近年來相關(guān)研究的不斷深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)：相較于傳統(tǒng)化療而言，吉非替尼用于一線治療的客觀緩解率、耐受性、生活質(zhì)量以及無進(jìn)展生存期均有顯著性優(yōu)勢，然而隨著治療時(shí)間的不斷延長，絕大部分患者均會發(fā)生獲得性耐藥[3]。有研究報(bào)道證實(shí)，吉非替尼等多種靶向藥物治療效果顯著的EGFR突變肺癌患者普遍存在Bim高表達(dá)，且通過誘導(dǎo)Bim高表達(dá)可提高吉非替尼治療的敏感性，促使腫瘤明顯縮小，且生存期延長，生活質(zhì)量提高[4]。而Bim低表達(dá)與表達(dá)缺失患者的病情往往進(jìn)展較快、治療效果較差。這提示了吉非替尼獲得性耐藥可能與凋亡蛋白Bim存在密切相關(guān)。鑒于此，本文通過研究Bim與EGFR敏感突變肺腺癌患者經(jīng)吉非替尼一線治療后獲得性耐藥的相關(guān)性，旨在為臨床治療提供數(shù)據(jù)支持，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 (1)細(xì)胞株來源：PC9與PCR/GR均由廣東科研所提供，且PC9對吉非替尼敏感，PC9/GR對吉非替尼耐藥：EGFR19外顯子突變，不存在T790M突變以及C-met擴(kuò)增。(2)儀器：超凈工作臺購自Sigma公司。倒置光學(xué)顯微鏡購自德國Leica公司。二氧化碳(CO2)細(xì)胞孵育箱與生物安全柜均購自新加坡ESCD公司。低速離心機(jī)、低溫高速離心機(jī)均購自美國Thermocoulter公司。分光光度計(jì)購自美國Thermo Fisher公司。冷凍恒溫培養(yǎng)搖床購自美國SI公司。蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司。低溫冰箱購自海爾集團(tuán)有限公司。流式細(xì)胞儀購自BD公司。(3)相關(guān)試劑：囊括胎牛血清，青鏈霉素混合液，DMEM高糖培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶-EDTA，1×PBS緩沖液，二甲基亞砜(DMSO)，吉非替尼(購自美國阿斯利康公司)，兔抗人BIM一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗、兔抗人GAPDH抗體(均購自美國CST公司)，電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液均購自北京酷來搏科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 研究方法 (1)肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9與PC9/GR的體外培養(yǎng)：將細(xì)胞冷凍管置入37℃水浴國內(nèi)解凍，使細(xì)胞懸液于1 min內(nèi)徹底融化，隨后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5 ml DMEM高糖培養(yǎng)液完全培養(yǎng)液的離心管內(nèi)，以800 r/min作為轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心處理，時(shí)長5 min。隨后去除上清液，加入5 ml的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，混勻后置入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)24 h，次日于高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞污染、特別情況，適當(dāng)更換培養(yǎng)液。貼壁細(xì)胞即為PC9與PC9/GR細(xì)胞，待其生長融合度≥90%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。待上述操作結(jié)束后通過倒置顯微鏡明確細(xì)胞生長狀態(tài)，并選擇細(xì)胞凍存前1 d更換新的細(xì)胞培養(yǎng)液。將10%DMEM與90%胎牛血清溶液作為細(xì)胞東村也，嚴(yán)格根據(jù)細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作收集細(xì)胞、離心、去除上清液，并加入適當(dāng)?shù)睦鋬霰４嬉?，混合均勻后分別裝于標(biāo)記好的凍存保存管內(nèi)，并置于-80℃冰箱中過夜。(2)吉非替尼加藥：待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，小心吸去96孔板內(nèi)培養(yǎng)上清液，分別于兩種細(xì)胞中加入0、1、5、10 μmol/L濃度的吉非替尼，將96孔板移至37℃、5% CO2恒溫箱內(nèi)，分別培養(yǎng)24 h與48 h。(3)細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)24 h和48 h后向每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl。培養(yǎng)箱孵育4 h后，輕輕吸取上清，避免結(jié)晶物吸出，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。加入200 μl DMSO，置搖床震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。后在570 mm波長的酶標(biāo)儀下讀出OD值。每組藥物濃度設(shè)置5個復(fù)孔，至少重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。(4)采用Western blot法檢測PC9及PC9/GR細(xì)胞Bim蛋白表達(dá)：取對數(shù)生長期細(xì)胞鋪滿6孔板，待細(xì)胞徹底貼壁后加入濃度為0、1、5、10 μmol/L的吉非替尼，放置在37℃、5% CO2恒溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。隨后進(jìn)行蛋白的提取以及定量檢測，使用掃描儀掃描膠片，使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，通過目的與該樣本內(nèi)參GAPDH的灰度比值，計(jì)算Bim蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 觀察指標(biāo) 比較不同劑量吉非替尼作用于PC9、PC9/GR細(xì)胞株24、48 h后的抑制率，不同劑量吉非替尼作用于PC9、PC9/GR細(xì)胞株24、48 h后的Bim蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量吉非替尼作用于PC9、PC9/GR細(xì)胞株24 h后的抑制率比較 在吉非替尼作用24 h后，隨著其劑量的不斷增加，PC9細(xì)胞的抑制率呈逐漸增加趨勢，各組間對比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而PC9/GR細(xì)胞抑制率的增加趨勢不明顯(P>0.05)。見表1。

吉非替尼劑量(μmol/L)PC9PC9/GR0 1.00±0.001.00±0.00125.08±3.49*0.38±7.12526.10±3.01*#5.52±7.191031.72±1.79*#△6.12±7.49F值52.1741.924P值0.0000.185

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05；與1 μmol/L比較，#P<0.05；與5 μmol/L比較,△P<0.05

2.2 不同劑量吉非替尼作用于PC9、PC9/GR細(xì)胞株48 h后的抑制率比較 在吉非替尼作用48 h后，隨著其劑量的不斷增加，PC9細(xì)胞的抑制率呈逐漸增加趨勢，4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而PC9/GR細(xì)胞抑制率的增加趨勢不明顯(P>0.05)。見表2。

2.3 不同劑量吉非替尼作用于PC9、PC9/GR細(xì)胞株24 h后的Bim蛋白表達(dá)水平比較 在吉非替尼作用24 h后，隨著其劑量的不斷增加，PC9細(xì)胞株Bim蛋白表達(dá)量呈逐漸增加趨勢，4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而PC9/GR細(xì)胞株Bim蛋白表達(dá)量的增加趨勢不明顯(P>0.05)。見表3。

吉非替尼劑量(μmol/L)PC9PC9/GR01.00±0.001.00±0.00132.37±4.20*1.98±1.80535.92±3.75*#6.33±10.521038.58±6.83*#△7.74±10.05F值24.5591.142P值0.0000.672

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05；與1 μmol/L比較，#P<0.05；與5 μmol/L比較,△P<0.05

吉非替尼劑量(μmol/L)PC9PC9/GR01.00±0.001.00±0.0010.67±0.12*0.60±0.0951.27±0.22*#0.78±0.04102.29±0.20*#△0.79±0.25F值38.7423.423P值0.0000.061

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05；與1 μmol/L比較，#P<0.05；與5 μmol/L比較,△P<0.05

2.4 不同劑量吉非替尼作用于PC9、PC9/GR細(xì)胞株48 h后的Bim蛋白表達(dá)水平比較 在吉非替尼作用48 h后，隨著其劑量的不斷增加，PC9細(xì)胞株Bim蛋白表達(dá)量呈逐漸增加趨勢，4組間對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而PC9/GR細(xì)胞株Bim蛋白表達(dá)量的增加趨勢不明顯(P>0.05)。見表4。

吉非替尼劑量(μmol/L)PC9PC9/GR01.00±0.001.00±0.0011.10±0.22*0.54±0.2851.74±0.19*#0.60±0.18102.91±0.30*#△0.74±0.20F值45.3763.423P值0.0000.061

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05；與1 μmol/L比較，#P<0.05；與5 μmol/L比較,△P<0.05

3 討論

迄今為止，關(guān)于吉非替尼耐藥的機(jī)制研究不少，主要集中于基因擴(kuò)增、缺失、突變以及信號通路變化，旁路激活、凋亡受阻等方面[5-7]。關(guān)于吉非替尼耐藥與凋亡受阻關(guān)系的研究并不多見，且大部分集中在促凋亡蛋白Bim和吉非替尼原發(fā)性耐藥的研究中[8-10]。而促凋亡蛋白Bim與獲得性耐藥的研究多集中在乳腺癌、胃癌、淋巴瘤、黑色素瘤中進(jìn)行，臨床上不少研究發(fā)現(xiàn)，藥物獲得性耐藥可能和Bim基因突變或多態(tài)性缺失及蛋白表達(dá)異常有關(guān)[11-13]?，F(xiàn)有研究報(bào)道證實(shí)：吉非替尼應(yīng)用于EGFR敏感突變的肺腺癌細(xì)胞株獲得顯著效果時(shí)，通過western blot技術(shù)檢測可發(fā)現(xiàn)Bim蛋白的表達(dá)存在明顯上調(diào)，而再敲除凋亡蛋白Bim表達(dá)后，會導(dǎo)致原先對吉非替尼敏感的細(xì)胞株發(fā)生改變，產(chǎn)生耐藥性[14-16]。

本文結(jié)果表明，在吉非替尼作用24、48 h后，隨著其劑量的不斷增加，PC9細(xì)胞的抑制率呈逐漸增加趨勢，且經(jīng)單因素方差分析可得：各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而PC9/GR細(xì)胞抑制率的增加趨勢不明顯(P>0.05)。這提示了吉非替尼敏感細(xì)胞株P(guān)C9相較耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR的生長更快。分析原因，筆者認(rèn)為可能與以下幾點(diǎn)有關(guān)：(1)與PC9/GR細(xì)胞株相比，PC9的貼壁速度更快，而貼壁速度快的細(xì)胞，往往分裂增殖能力較強(qiáng)，細(xì)胞繁殖速度亦較快。(2)PC9/GR細(xì)胞株的貼壁能力較強(qiáng)，消化難度較大，可于一定程度上反映細(xì)胞黏附能力較強(qiáng)，而隨著細(xì)胞粘附力的不斷增強(qiáng)，細(xì)胞繁殖速度更慢；(3)PC9和PC9/GR均可表達(dá)目的蛋白Bim，在予以差異性濃度吉非替尼進(jìn)PC9與PC9/GR細(xì)胞的干預(yù)時(shí)，PC9細(xì)胞株中Bim基礎(chǔ)表達(dá)量顯著增高，而細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要途徑是通過促凋亡蛋白Bim所實(shí)現(xiàn)，隨著Bim蛋白表達(dá)的增加，加快細(xì)胞凋亡[17,18]。此外，在吉非替尼作用24 h、48 h后，隨著其劑量的不斷增加，PC9細(xì)胞株Bim蛋白表達(dá)量呈逐漸增加趨勢，且經(jīng)單因素方差分析可得：各組間對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而PC9/GR細(xì)胞株Bim蛋白表達(dá)量的增加趨勢不明顯(P>0.05)。這表明了敏感細(xì)胞株中Bim表達(dá)增加，而耐藥細(xì)胞株中Bim表達(dá)相對減少的，提示了Bim對吉非替尼敏感性及耐藥性存在密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[19,20]，吉非替尼產(chǎn)生的獲得性耐藥與Bim表達(dá)下調(diào)有密切關(guān)系。

綜上所述，Bim蛋白減少可能與吉非替尼一線治療獲得性耐藥有關(guān)，但其具體機(jī)制尚且需更深入的研究證實(shí)。