伍怡佳，姚 華,范玉華

(北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

隨著動(dòng)物醫(yī)療的發(fā)展，寵物犬老年疾病的患病率和診斷需求也不斷增加。乳腺腫瘤是母犬最常見的腫瘤，在9至11歲的老齡母犬群體中多發(fā)，其發(fā)病率占母犬腫瘤數(shù)量的50%，犬的惡性乳腺腫瘤較為常見[1]，發(fā)病率與死亡率都非常高。因此，需要有效的檢測手段。

缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)在醫(yī)學(xué)臨床上已被公認(rèn)為重要的癌癥藥物靶標(biāo)，其最初是作為一種生物O2傳感器被發(fā)現(xiàn)，可使機(jī)體適應(yīng)缺氧狀態(tài)。HIF-1是一個(gè)異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成，(或其類似物 HIF-2α和 HIF-3α)。其中，HIF-1α是氧敏感亞基，在低氧條件下誘導(dǎo)其發(fā)生表達(dá)[2-4]。

本試驗(yàn)檢測缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)在犬乳腺腫瘤組織中的表達(dá)，分析其與犬乳腺腫瘤性質(zhì)的關(guān)系，探明其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

2017—2019年間在北京市多家寵物醫(yī)院收集疑似犬乳腺腫瘤樣本20例，并經(jīng)獸醫(yī)師和寵物主人同意后用于試驗(yàn)研究。

1.2 主要試劑

DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)、兔二步法檢測試劑盒(PV-9001)、兔抗人缺氧誘導(dǎo)因子-1α單克隆抗體(ZA-0552)、免疫組化抗原修復(fù)緩沖液(EDTA抗原修復(fù)液pH 8.0)均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。分析純酒精、分析純二甲苯及PBS均購自北京試劑公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病理組織學(xué)觀察 將疑似犬乳腺腫瘤樣本在4%多聚甲醛中固定24 h，之后切成1 cm3的小塊放入包埋盒中流水沖洗6～8 h，隨后進(jìn)行脫水、浸蠟及包埋處理，制成蠟塊。使用病理切片機(jī)將蠟塊切成4 μm的薄片后進(jìn)行病理組織學(xué)鑒定和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。通過世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行分類，判定其腫瘤的性質(zhì)。

1.3.2 免疫組織化學(xué)方法 制作石蠟切片，載玻片使用陽離子防脫片。將4 μm的薄片進(jìn)行脫蠟水化后，用PBS洗3次，每次3 min。在高壓鍋內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后用PBS洗3次，每次3 min。加入內(nèi)源性過氧化物阻斷酶，避光反應(yīng)12 min后，用PBS洗3次，每次3 min。加入一抗，4 ℃過夜，復(fù)溫后37 ℃烘箱反應(yīng)1 h。用PBS單獨(dú)沖洗一抗，防止污染陰性對(duì)照。加入反應(yīng)增強(qiáng)液，37 ℃烘箱反應(yīng)20 min，用PBS洗3次，每次3 min。加入增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物，37 ℃烘箱反應(yīng)20 min，用PBS洗3次，每次3 min。最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明后用中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。HIF-1蛋白的陽性部位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，顯微鏡下以清晰的有棕黃色、黃色的顆粒為有HIF-1蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS20 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，選用 fisher’s 精確檢驗(yàn)法、Pearson 相關(guān)性分析對(duì) HIF-1α蛋白在良性腫瘤組與惡性腫瘤組之間的表達(dá)情況進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。若P<0.05 表示 HIF-1α在不同性質(zhì)的犬乳腺腫瘤中表達(dá)存在顯著差異，并且差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；若P>0.05 表示差異不顯著，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

選取細(xì)胞計(jì)數(shù)比對(duì)[5-6]。HIF-1α以胞漿和胞核中出現(xiàn)清晰的黃色或黃褐色顆粒為陽性染色。其陽性結(jié)果判斷：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為“-”，5%～25%為“+”；陽性細(xì)胞數(shù) 26%～50%為 “++”；陽性細(xì)胞數(shù) 51%～75%為“+++”；陽性細(xì)胞數(shù)>75%為“++++”。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤性質(zhì)的病理組織學(xué)分析

收集到疑似犬乳腺腫瘤病例20 例，經(jīng)病理組織學(xué)觀察得出良性乳腺腫瘤6 例，占犬乳腺腫瘤病例的30%；惡性乳腺腫瘤14例，占全部病例數(shù)的70%?？梢姡瑦盒阅[瘤的發(fā)病率超過良性乳腺腫瘤，應(yīng)引起臨床獸醫(yī)的高度關(guān)注。

本試驗(yàn)將所收集病例進(jìn)行組織學(xué)分型，結(jié)果見表1。

表1 不同乳腺腫瘤組織學(xué)特點(diǎn)Tab.1 Histological characteristics of different breast tumors

圖1為犬浸潤性導(dǎo)管癌組織切片分別為 HE 染色在 4 倍鏡、40 倍鏡下的圖像。圖 1組織結(jié)構(gòu)紊亂，伴有部分出血壞死的特征，乳腺導(dǎo)管結(jié)構(gòu)不完整，間質(zhì)內(nèi)存在大量同質(zhì)細(xì)胞。其中可清晰地看到腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)嗜酸，胞核部分有分裂象。而良性腫瘤組織分化好、異型性小，基本無或者很少可見病理核分裂象。

圖1 浸潤性導(dǎo)管癌病理切片F(xiàn)ig.1 Pathological section of invasive ductal carcinoma

2.2 HIF-1蛋白在犬乳腺腫瘤中的表達(dá)

如表 2 所示，對(duì) HIF-1α蛋白在良性腫瘤組與惡性腫瘤組之間的表達(dá)情況進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果P<0.05，表示 HIF-1α在不同性質(zhì)的犬乳腺腫瘤中表達(dá)存在顯著差異，且差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，犬惡性乳腺腫瘤中 HIF-1α的表達(dá)顯著高于良性乳腺腫瘤，陽性表達(dá)率為85.7%。

表2 犬乳腺腫瘤組織中 HIF-1α蛋白的表達(dá)

Tab.2 Expression of HIF-1α protein in canine mammary tumor tissues

將本試驗(yàn)的20例犬乳腺腫瘤樣本進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表3。圖2分別從4倍鏡、10倍鏡、40倍鏡下展示了 HIF-1α在浸潤性導(dǎo)管癌組織中陰性和陽性的表達(dá)。從圖中可以看出，HIF-1α的陽性表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的胞核和胞漿中，呈現(xiàn)典型的黃色甚至黃褐色。

表3 HIF-1α在犬乳腺腫瘤中的定量分析統(tǒng)計(jì)

Tab.3 Quantitative analysis and statistics of HIF-1α in canine breast tumors

圖2 不同倍鏡下的浸潤性犬乳腺癌免疫組織化學(xué)切片F(xiàn)ig.2 Immunohistochemical section of invasive canine breast cancerunder different magnifications

3 討論和結(jié)論

3.1 HIF-1蛋白對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響

缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是缺氧條件下細(xì)胞產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子,是體內(nèi)維持細(xì)胞內(nèi)氧平衡的主要調(diào)控因子[7]。在正常條件下，HIF 的 a 亞基被蛋白酶體快速降解，但在低氧條件下穩(wěn)定下來。在低氧條件下，氧成為限制前體羥基化的速率，并且HIF-1a 的周轉(zhuǎn)率相應(yīng)地降低，使 HIF-1a 在細(xì)胞內(nèi)積累[8]。缺氧從而引起基因上調(diào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)低氧狀態(tài)下的能量代謝和氧的運(yùn)輸[9]。

腫瘤發(fā)生過程中，實(shí)體病變首先經(jīng)歷一個(gè)無血管的生長階段，細(xì)胞迅速生長增殖，直到氧氣的擴(kuò)散和廢物和營養(yǎng)物質(zhì)的交換成為速率限制。而腫瘤組織細(xì)胞的生長和存活依賴于它們促進(jìn)血管生成和適應(yīng)缺氧條件的能力。盡管微血管密度會(huì)增加，即使是大腫瘤，其血管結(jié)構(gòu)和功能也會(huì)異常，導(dǎo)致局部缺氧[8]。

HIF-1α不僅是重要的調(diào)控氧平衡的轉(zhuǎn)錄因子，還可以通過激活其他因子，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，如激活血管的轉(zhuǎn)錄內(nèi)皮生長因子(VEGF)，反過來促進(jìn)血管生成通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長、遷移和侵襲形成新的血管，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[10]。在大多數(shù)腫瘤中 HIF-1α過量產(chǎn)生，并與不同目的基因缺氧反應(yīng)原件中的一段共有序列結(jié)合，增加了腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下的存活，促進(jìn)腫瘤生長[11]。此外，還有研究表明中止缺氧誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，在體內(nèi)和體外均抑制腫瘤生長。與腫瘤密切相關(guān)的原癌基因、抑癌基因和生長因子均與 HIF-1α有密切的聯(lián)系[12]。因此，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程與 HIF-1α密不可分。

3.2 HIF-1蛋白的過表達(dá)對(duì)犬乳腺腫瘤良惡性變化的作用

本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了 HIF-1α在 20 例犬乳腺腫瘤中的表達(dá)情況。其中有 6 例良性乳腺腫瘤，均未有陽性結(jié)果出現(xiàn)，而在惡性腫瘤組織中HIF-1α的表達(dá)率很高，14 例惡性腫瘤組織中有 12 例出現(xiàn)陽性結(jié)果，陽性率達(dá)到85.7%。且其中有 4 例呈現(xiàn)出強(qiáng)陽性，組織片呈現(xiàn)深染黃色甚至黃褐色。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，HIF-1α在惡性乳腺腫瘤中的表達(dá)率顯著高于良性組織中(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，HIF-1α與犬惡性乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。

研究提示，HIF-1α在乳腺癌中可能扮演著重要的角色。如腫瘤微環(huán)境研究發(fā)現(xiàn)腫瘤缺氧是影響臨床預(yù)后的重要因素，可促進(jìn)腫瘤的遺傳不穩(wěn)定性、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲性[13]。腫瘤啟動(dòng)缺氧是發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)子。缺氧會(huì)改變癌細(xì)胞的新陳代謝，通過誘導(dǎo)細(xì)胞靜止增加對(duì)治療的抵抗力[14]。因此，腫瘤組織微環(huán)境缺氧也是腫瘤治療效果差，易產(chǎn)生放化療耐受的原因之一。

據(jù)報(bào)道，在醫(yī)學(xué)臨床上90%的乳腺腫瘤的死亡是由于轉(zhuǎn)移所致，轉(zhuǎn)移常與血管生成有關(guān)[15]。HIF-1α可以激活血管的轉(zhuǎn)錄內(nèi)皮生長因子(VEGF)，促進(jìn)血管生成通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長、遷移和侵襲形成新的血管，促進(jìn)腫瘤不斷發(fā)生發(fā)展，HIF-1α還可以通過與其他因子相互作用，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與MTDH相互作用共同作用于乳腺癌轉(zhuǎn)移過程，除此之外，HIF-1α也與E-cadherin 相互作用，共同促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移作用[16-17]。因此，HIF-1α在腫瘤惡性癌變中有重要意義。

在免疫組化染色中，HIF-1α在犬惡性乳腺腫瘤組織中高表達(dá)、結(jié)果對(duì)比清晰明白(黃色和藍(lán)色對(duì)比)易于統(tǒng)計(jì)分析。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是缺氧條件下腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，且作為癌癥指標(biāo) HIF-1α容易測量、可對(duì)腫瘤發(fā)病過程及預(yù)后進(jìn)行判斷，而且隨著免疫組化技術(shù)的不斷發(fā)展，可以便捷簡單快速的測量 HIF-1α轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。因此，HIF-1α可以作為乳腺癌敏感指標(biāo)來進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。

HIF-1α在犬惡性乳腺腫瘤中的表達(dá)顯著高于良性乳腺腫瘤，對(duì)腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)有重要的臨床參考價(jià)值。