曹 莉，孫 路，孔梓安，吳竹青，別鵬飛，王 真*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，獸醫(yī)學(xué)(中獸醫(yī))北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

沙門氏菌屬于革蘭氏陰性菌兼胞內(nèi)寄生菌，能夠感染人與動物，腸炎沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphimurium)簡稱鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)是一種腸道致病菌，具有廣泛的宿主，是目前分離率最高的菌型之一，哺乳動物以及人類容易感染該沙門氏菌，容易引發(fā)全身性感染，在公共衛(wèi)生方面有著重要意義[1]。

目前為止抗生素相關(guān)的抗菌藥物的使用，使得沙門氏菌耐藥性增加，構(gòu)建沙門氏菌減毒疫苗成為了沙門氏菌主要預(yù)防和防治手段。沙門氏菌通過基因工程的方法進(jìn)行減毒，對人和動物的致病力顯著降低，并且可以保持良好的免疫原性[2]。目前已經(jīng)多個與沙門氏菌毒力相關(guān)基因被檢測出來，可以構(gòu)建一系列毒力突變的減毒活疫苗。在S.Typhimurium中，20種氨基酸中除賴氨酸外的每一種都需要特異性的同源氨基酰基-tRNA合成酶。S.Typhimurium中yjeA基因編碼沙門氏菌中第二種賴氨酰-tRNA合成酶。Kaniga[3-4]首次報(bào)道了yjeA基因突變對細(xì)菌毒力有影響，但未見系統(tǒng)關(guān)于S.TyphimuriumyjeA基因缺失作為疫苗候選株的報(bào)道，本研究以yjeA基因?yàn)槟繕?biāo)基因，采用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建了基因缺失突變株，研究了其生長特性、細(xì)胞粘附力、侵襲力小鼠載菌量與免疫原性等，進(jìn)而為開發(fā)更加安全有效的S.typhimurium弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 廣東菌種保藏中心購入并由獸醫(yī)學(xué)(中獸醫(yī))北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的沙門氏菌S.TyphimuriumATCC 14028s、大腸桿菌；由該實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pKD46，pKD3，pCP20，以及互補(bǔ)質(zhì)粒pBR322 。

1.1.2 細(xì) 胞 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞J774A.1由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳清民教授實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基、試劑和試驗(yàn)動物 北京擎科生物技術(shù)有限公司購買DNA凝膠回收試劑盒；在Biowest公司購買胎牛血清(FBS)。在維通利華有限公司購買的 SPF級 BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 沙門氏菌基因缺失株及互補(bǔ)株引物詳見表1。

根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，詳見表1。

1.2.2 沙門氏菌yjeA基因缺失株的構(gòu)建 以pKD3為模板，F(xiàn)1、F2為引物擴(kuò)增打靶基因片段，長度約為1 100 bp。用北京艾德萊有限公司質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pKD46和pCP20。將提取的pKD46質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入沙門氏菌S.typhimuriumATCC14028(ST)中(電壓為1.8 kV)。電轉(zhuǎn)后于復(fù)蘇，將復(fù)蘇菌液涂布于LB/Amp(LB培養(yǎng)基中加入濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素)平板上，恒溫培養(yǎng)挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中，以該菌液為模板，F(xiàn)1、F2為引物進(jìn)行PCR鑒定，選擇陽性菌落保存。制備含有pKD46質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞[5]，將目的基因片段電轉(zhuǎn)入上述感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)后復(fù)蘇菌液涂布于LB/Cm(氯霉素濃度為34 μg/mL)平板上，恒溫培養(yǎng)后挑取單菌落于進(jìn)行培養(yǎng)，以該菌液為模板，以F3、F4為引物進(jìn)行鑒定，選擇陽性菌落進(jìn)行保存。整合氯霉素抗性基因的陽性菌落于LB/Cm液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行pKD46質(zhì)粒消除，使用整合自子制備感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)pCP20質(zhì)粒，菌液涂布LB/Amp平板于過夜培養(yǎng)；挑取單菌落加入LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行pCP20質(zhì)粒消除。用引物F3、F4檢測氯霉素抗性基因是否消除，目標(biāo)基因是否缺失，構(gòu)建成功的yjeA基因缺失株命名為SMΔyjeA。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物Tab.1 The primer sequences for PCR amplification

1.2.3SMΔyjeA互補(bǔ)菌株的構(gòu)建 以親本菌株為模板，F(xiàn)5、F6為引物進(jìn)行yjeA基因序列擴(kuò)增，提取pBR322質(zhì)粒，將純化的基因產(chǎn)物以及質(zhì)粒進(jìn)行酶切連接轉(zhuǎn)化，選取LB/Amp平板上生長的單菌落增殖后鑒定陽性互補(bǔ)質(zhì)粒。制備沙門氏菌yjeA基因缺失株感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)互補(bǔ)質(zhì)粒，挑取LB/Amp平板上生長的單菌落，PCR鑒定，將陽性菌命名為SMCyjeA。

1.2.4SMΔyjeA生長特性測定 為測定沙門氏菌SM、SMΔyjeA生長特征，取單菌落于10 mL LPM液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，檢測OD600值，繪制生長曲線。

1.2.5 細(xì)胞感染試驗(yàn) 將過夜培養(yǎng)的SM、SMΔyjeA、SMCyjeA滴板計(jì)數(shù)，感染巨噬細(xì)胞，室溫離心培養(yǎng)20 min；棄掉培養(yǎng)液，加入含50 μg/mL慶大霉素的2%維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于不同時間點(diǎn)取樣，裂解細(xì)胞，測定各菌株侵染細(xì)胞和在細(xì)胞內(nèi)的生存能力。

1.2.6 SMΔyjeA小鼠體內(nèi)毒力測定 胞內(nèi)寄生病原菌，在機(jī)體內(nèi)臟器載菌量及體內(nèi)增值存留時間，是評價毒力的一個重要標(biāo)準(zhǔn)，詳見文獻(xiàn)[6]。選購BALB/c小鼠分別腹腔注射SM、SMΔyjeA，SMCΔyjeA，注射后記錄小鼠死亡情況并分別于7 d、14 d和21 d選取小鼠處死，進(jìn)行臟器載菌量測定。

1.2.7 SMΔyjeA免疫原性檢測 挑取SMΔyjeA菌液超聲破碎離心上清液為包被抗原，測定其濃度；將制備好的抗原用包被液的倍比稀釋，放置于4 ℃包被過夜進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。陽性血清和陰性血清倍比稀釋加入到反應(yīng)板中，確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。

將BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組，免疫組將SMΔyjeA腹腔注射小鼠，對照組腹腔注射滅菌PBS，取血并分離血清，免疫組和對照組分離的血清為一抗，兔抗鼠二抗購于北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司，用間接ELISA對血樣進(jìn)行檢測，記錄血液抗體的動態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌yjeA基因缺失株篩選與鑒定的結(jié)果

以F3、F4作為引物，擴(kuò)增氯霉素抗性基因替換株、目標(biāo)基因缺失株和野生菌株，分別觀察到不同大小的條帶∶氯霉素抗性基因條帶為1 100 bp、基因缺失株SMΔyjeA條帶為160 bp，SM條帶為980 bp。如圖1，結(jié)果表明成功構(gòu)建出沙門氏菌基因缺失株SMΔyjeA。

2.2 沙門氏菌SMΔyjeA互補(bǔ)菌株篩選與鑒定的結(jié)果

用F5、F6為引物，以野生菌株、基因缺失株、互補(bǔ)菌株為模板，檢測目標(biāo)基因缺失株、親本株和互補(bǔ)菌株，分別觀察到條帶如圖(圖2)：親本菌株條帶為980 bp、基因缺失株條帶為160 bp、互補(bǔ)菌株條帶分別為980 bp與160 bp，結(jié)果表明成功構(gòu)建出沙門氏菌yjeA基因缺失株互補(bǔ)菌株即SMCyjeA。

M.DL5000；1.氯霉素抗性基因替換株；2.yje A基因缺失株；3.野生菌株圖1 缺失株SMΔyjeA株P(guān)CR鑒定 M.DL5000;1.Chloramphenicol-resistant gene substitutes;2.yjeA gene deleted strain;3.Wild strainsFig.1 Identification of deleted SM yjeA strain by PCR

M.DL5000；1.親本菌株；2.yjeA基因缺失株；3.yjeA基因缺失株互補(bǔ)菌株圖2 缺失株SMΔyjeA株P(guān)CR鑒定 M.DL5000;1.Parent strains;2.yjeA gene deleted strain;Complementary strains with 3.yjeA gene deletionFig.2 Identification of deleted SM yjeA strain by PCR

2.3 生長特性觀察結(jié)果

將SM、SMΔyjeA經(jīng)LPM培養(yǎng)基37 ℃震蕩培養(yǎng)，在不同時間點(diǎn)分別取樣，測定OD值，以時間為橫軸，OD600為縱軸繪制生長曲線如圖3所示，培養(yǎng)6 h后，基因缺失株SMΔyjeA培養(yǎng)液OD值略低于親本菌株SM，差異略顯著。說明，yjeA基因的缺失對沙門氏菌SMΔyjeA的正常生長略有影響。

2.4 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)和黏附試驗(yàn)結(jié)果

將SM、SMΔyjeA、SMCyjeA以MOI為10的劑量感染巨噬細(xì)胞，感染后在不同時間點(diǎn)取樣，進(jìn)行胞內(nèi)活菌計(jì)數(shù)，如圖4-5所示，感染1 h時，3株菌胞內(nèi)載量分別為1.9×105、6.25×104、1.45×105(LOG10為5、4、5)。SMΔyjeA與SM相比降低0.5個數(shù)量級；感染4 h開始，SM和SMCyjeA在胞內(nèi)大量增殖，16 h后胞內(nèi)細(xì)菌量達(dá)到4×106(LOG10為6)，而SMΔyieA增殖速度緩慢，12 h時胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量逐漸減少，比SM降低1.5個數(shù)量級。由此表明，yjeA基因的缺失影響了沙門氏菌胞內(nèi)生存能力，對侵襲力影響不大，并不影響粘附力，沙門氏菌基因缺失株SMΔyjeA會在胞內(nèi)被緩慢的殺死。

圖3 基因缺失株SMΔyjeA與親本株SM的生長特性Fig.3 Growth of SMΔyjeA and its parent SM

圖5 細(xì)胞黏附力和侵襲力測定結(jié)果Fig.5 Results of cell adhesion and invasiveness

2.5 小鼠體內(nèi)毒力試驗(yàn)結(jié)果

為了研究yjeA基因?qū)ι抽T氏菌毒力的影響，將SM、SMΔyjeA、SMCyjeA以相同劑量接種小鼠，觀察小鼠死亡情況，同時測定了感染不同時間點(diǎn)的臟器載菌量。結(jié)果如圖6所示，接種SM和SMCΔyjeA的小鼠在14 d內(nèi)全部死亡，接種SMCyjeA的小鼠21 d的存活率為100%；接種7 d后脾臟與肝臟載菌試驗(yàn)結(jié)果表明，接種SM的小鼠肝臟脾臟載菌量均高于接種SMΔyjeA的小鼠近2個數(shù)量級；14 d時，與SM相比，基因缺失株SMΔyjeA在肝臟、脾臟的菌量分別為105和104CFU(LOG10為4和5)，低于接種SM的小鼠近4個數(shù)量級；接種14 d后，基因缺失株SMΔyjeA的肝臟和脾臟的載菌量在緩慢降低，在第21天降低為102CFU(LOG10為2 )。以上結(jié)果表明，yjeA基因與沙門氏菌毒力相關(guān)，敲除yjeA基因使得沙門氏菌毒力降低。

圖6 小鼠肝臟和脾臟內(nèi)載菌量Fig.6 bacterial load in mouse liver and spleen

2.6 免疫原性測定結(jié)果

將基因缺失株SMΔyjeA以5×103CFU/只接種小鼠，不同時間點(diǎn)采集血液分離血清測定特異性抗體，結(jié)果如圖7所示，基因缺失株接種后7 d，血清中即可檢測到特異性抗體，隨著接種時間延長，血清效價逐漸升高，16 d時達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，免疫組明顯高于對照組。

圖7 小鼠體內(nèi)IgG檢測結(jié)果Fig.7 IgG detection results in mice

3 討 論

S.Typhimurium是一種可以導(dǎo)致局部或全身感染的胞內(nèi)病原體，通過基因工程的方法進(jìn)行減毒可以降低其對宿主的致病性，且仍然保持良好的侵襲力[7]。近年來，通過基因工程方法構(gòu)建減毒沙門氏作為疫苗載體表達(dá)外源抗原已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[8]。在S.Typhimurium的必需氨基酸中，除了賴氨酸外以外都需要特異性的同源氨基?；?tRNA合成酶。氨?；?tRNA(aaRSs)合成酶家族包括20種經(jīng)典酶，其在翻譯過程中將氨基酸與相應(yīng)的tRNA匹配。yjeA基因是一種賴氨酸-tRNA合成酶的旁系同源物，它不識別tRNA，而是在翻譯后修飾延伸因子P(EF-P)，這是一種在形狀和大小上模擬tRNA的蛋白質(zhì)。EF-P修飾導(dǎo)致蛋白質(zhì)組的特異性改變，并且這是沙門氏菌毒力必須的[9]。隨著對沙門氏菌毒力相關(guān)的DNA的了解，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多與沙門氏菌毒力相關(guān)的基因，例如cya/crp缺失株沙門氏菌突變株不僅毒力減毒，并且保留了良好的免疫原性[10-12]。這與本研究結(jié)果一致，表明yjeA基因有望成為沙門氏菌疫苗候選基因。

與傳統(tǒng)的基因敲除方法相比，Red重組系統(tǒng)進(jìn)行的基因敲除重組效率明顯提高，利用此方法直接線性打靶DNA，不需要構(gòu)建打靶質(zhì)粒，因此試驗(yàn)周期大大縮短[13-14]。本研究利用Red重組系統(tǒng)缺失yjeA基因，成功構(gòu)建了沙門氏菌yjeA基因缺失株。通過生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，SMΔyjeA生長較為穩(wěn)定。細(xì)胞感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，yjeA基因的缺失不影響細(xì)菌粘附力和侵襲力，但是對于影響胞內(nèi)定殖有顯著地影響，由此可見基因缺失株SMΔyjeA在細(xì)胞內(nèi)生長受到限制，表明SMΔyjeA毒力降低。小鼠試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射親本菌株的小鼠在第14 d內(nèi)全部死亡，而注射SMΔyjeA的小鼠存活率為100%，且體內(nèi)肝臟和脾臟的細(xì)菌數(shù)量明顯低于親本菌。由此推測，yjeA基因缺失沙門氏菌毒力顯著降低。此外，SMΔyjeA接種小鼠后7 d 產(chǎn)生抗體，具有良好的免疫原性。

綜上所述，本研究構(gòu)建了沙門氏菌yjeA基因缺失株，該缺失株生長速率穩(wěn)定，體內(nèi)外毒力降低，且具有良好的免疫原性。由此表明，SMΔyjeA有望用于腸炎沙門氏菌減毒活疫苗的研發(fā)。