藥明康德醫(yī)療器械測試中心 （江蘇 蘇州 215124）

內(nèi)容提要： MTT細胞毒性試驗為常見的細胞毒性試驗，其廣泛地應(yīng)用于國內(nèi)外醫(yī)療器械生物相容性檢測并為ISO10993所推薦。文章就該試驗的幾項參數(shù)細胞代數(shù)、加樣時間、血清類型和陰性對照毒性范圍等對該試驗的影響進行了驗證，以說明在該中心試驗條件下該試驗的穩(wěn)定性，同時為標準實驗操作提供參考。

醫(yī)療器械標準是醫(yī)療器械研發(fā)、生產(chǎn)和監(jiān)督管理共同遵守的技術(shù)規(guī)范。隨著醫(yī)療器械產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，醫(yī)療器械的安全檢測對產(chǎn)品安全有效和推動產(chǎn)業(yè)發(fā)展的作用與日俱增，如何科學穩(wěn)定地按照標準對醫(yī)療器械進行檢測尤為重要。體外細胞毒性試驗是醫(yī)療器械安全性檢測的重要試驗，而MTT法尤為廣泛。

本試驗通過檢測暴露于供試品浸提液后的細胞新陳代謝活動的變化，進而獲得其對細胞活力的影響。未被代謝的MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）呈現(xiàn)黃色，當其被活細胞代謝消耗后變成難溶的藍紫色甲瓚。用異丙醇溶解甲瓚并測量吸光度，活細胞的數(shù)量與顏色強度相關(guān)。活細胞數(shù)量的減少使其總體活力減少，這一減少與藍紫色甲瓚的形成數(shù)量直接相關(guān)，變化大小可以通過測量光密度獲得。本研究通過對MTT細胞毒性所涉及到的細胞代數(shù)，血清類型，給藥時間以及陰性對照進行了確認和研究，為企業(yè)供試品生物相容性測試提供參考。

1.材料與方法

1.1 儀器、耗材與試劑

生物安全柜，高壓蒸汽滅菌鍋，MEM培養(yǎng)基，胎牛血清，小牛血清，酶標儀，高密度聚乙烯（HDPE）。

圖1. L-929細胞（高密度）

1.2 細胞代數(shù)參數(shù)

L-929小鼠成纖維細胞為細胞毒性試驗常用細胞系，為貼壁細胞，每傳代一次需進行消化一次。本試驗通過相差11代的細胞對同一供試品進行檢測，并將數(shù)據(jù)進行對比，以驗證隨著細胞代數(shù)的增加，該細胞系的檢測敏感度有所變化。

細胞系：L-929，美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；細胞凍存：將細胞消化成單細胞懸液，將細胞密度調(diào)整為約1×106cells/mL；液氮長期儲存（-196°C）細胞代數(shù)：P572和P561。細胞培養(yǎng)狀態(tài)見圖1。

1.3 給藥時間參數(shù)

細胞接種后需要將細胞原培養(yǎng)基去除加入供試品浸提液/溶液，細胞的給藥一般從左向右，而加樣的速率和時間可能會對試驗的結(jié)果產(chǎn)生影響，因此標準方法將空白對照加于左右兩側(cè)進行質(zhì)控。本試驗通過以不同的速率給藥分別按照大約2、3、5、7、9、11、15和30min給完一個細胞板，從而判斷細胞在原培養(yǎng)基去除之后因給藥速率不同暴露時間不同而對試驗結(jié)果的影響。

1.4 血清類型參數(shù)

胎牛血清取自剖腹產(chǎn)胎牛，小牛血清取自出生24h之內(nèi)的新生牛。兩種血清均可作為細胞培養(yǎng)基的重要添加成份，冷凍存放，使用前融化添加，而兩者所含抗體、補體成分是存在一定差異的。本試驗采用小牛血清和胎牛血清的培養(yǎng)基對不同的測試材料進行測試對比以期發(fā)現(xiàn)其對MTT細胞測試結(jié)果的影響。

1.5 陰性對照

醫(yī)療器械的MTT細胞毒性試驗需要同時測試陰性材料，并且其結(jié)果應(yīng)當保持穩(wěn)定的陰性。本中心使用Hatano研究所食品藥品安全中心獲取的高密度聚乙烯材料（HDPE）并對其進行了約4個月的測試監(jiān)控從而獲得該陰性材料毒性歷史值供參考。

2.結(jié)果與討論

2.1 細胞代數(shù)參數(shù)

本設(shè)施通過浸提實驗室手套并調(diào)整給藥濃度以獲得特定毒性濃度使用代數(shù)P572和P561的L-929細胞進行試驗，細胞毒性結(jié)果見表1。

從表格數(shù)據(jù)以及對比可以發(fā)現(xiàn)20%試驗手套浸提液在P561和P572細胞上表現(xiàn)出64.53%到76.74%的細胞活力，15%試驗手套浸提液在P561和P562細胞上表現(xiàn)出85.09%到92.31%的細胞活力，10%試驗手套浸提液在P561和P562細胞上表現(xiàn)出79.75%到87.18%的細胞活力，差異范圍為-6.43%～7.22%，無顯著性差異。細胞類型細胞毒性對比見圖2。

2.2 給藥時間參數(shù)

本試驗通過浸提實驗室手套獲得毒性浸提液，并對其進行稀釋以得到不同程度的細胞毒性反應(yīng)。根據(jù)給藥時間快慢，即細胞暴露時間不同數(shù)據(jù)總結(jié)見表2。

從數(shù)據(jù)總結(jié)表和曲線圖（見圖3）可以發(fā)現(xiàn)，10%的手套浸提液在2min給藥情況下活力為87.35%，30min后給藥活力為85.27%。15%的手套浸提液在2min給藥情況下活力為75.70%，30min后給藥活力為81.09%。20%的手套浸提液在2min給藥情況下活力為39.51%，30min后給藥活力為55.03%。25%的手套浸提液在2min給藥情況下活力為21.81%，30min后給藥活力為30.13%。總之，低中高濃度毒性的供試品浸提液的給藥速度/給藥等待時間在30min54s內(nèi)無顯著變化，可見細胞在空氣中的暴露在0.5h內(nèi)是不會影響MTT測試結(jié)果的。

2.3 血清類型參數(shù)

本參數(shù)驗證使用兩種培養(yǎng)基對三種材料，non-PVC膜袋，實驗室手套，膠塞進行了浸提，浸提液稀釋后按照一定的稀釋比例進行MTT測試，具體數(shù)據(jù)見表3，對比柱狀圖見圖4（FBS：胎牛血清；NBS：新生牛血清/小牛血清）。

表1. 不同代數(shù)對同一給藥制劑的細胞毒性表現(xiàn)

圖2. 細胞類型細胞毒性對比柱狀圖

表2. 不同毒性浸提液在時間梯度延長時所表現(xiàn)出的細胞活力總結(jié)表

圖3. 不同毒性浸提液在時間梯度延長時所表現(xiàn)出的細胞活力總結(jié)曲線圖

表3.胎牛血清培養(yǎng)基和小牛血清培養(yǎng)基作為浸提介質(zhì)時在不同材料上的細胞活力表現(xiàn)(%)

所選Non-PVC膜袋為陰性結(jié)果，細胞活力分別為105.5%和96.53%。所選實驗手套為顯著毒性，活力分別為1.96和2.1%，所稀釋梯度毒性無差異。在兩種血清環(huán)境下未表現(xiàn)出顯著不同。膠塞為中等毒性材料，在此材料上兩種介質(zhì)浸提液表現(xiàn)出了一定的差異性，如Plug1 50%浸提液活力分別為79.46和90.14%，相差約11%，Plug2 100%浸提中活力分別為60.64%和75.67%，相差約15%。并且所有Plug材料的毒性表現(xiàn)小牛血清高于胎牛血清。說明在本試驗條件下某些特定材料可能會表現(xiàn)出活力差異，這一結(jié)論需要進一步的測試證明。

2.4 陰性對照

MTT細胞毒性試驗的陰性對照需要保持70%以上，其毒性表現(xiàn)往往受到批次、制備等過程的影響。本實驗室對該結(jié)果進行了連續(xù)4個月的監(jiān)控，結(jié)果見圖5。數(shù)據(jù)表明，絕大部分HDPE的活力范圍在90%～100%，表明該試驗在本實驗室條件下具有很好的穩(wěn)定性。

圖4. 胎牛血清培養(yǎng)基和小牛血清培養(yǎng)基作為浸提介質(zhì)時在不同材料上的細胞活力表現(xiàn)對比柱狀圖

圖5. MTT細胞毒性試驗的陰性對照結(jié)果

3.小結(jié)

本研究中數(shù)據(jù)表明，MTT細胞毒性試驗所采用的L-929細胞代數(shù)差異在11代以內(nèi)不會引起測試結(jié)果的不同。原培養(yǎng)基移出后，給藥時間在30min54s內(nèi)對試驗結(jié)果無顯著影響，因此該給藥時間控制在0.5h內(nèi)完成不會對供試品活力產(chǎn)生影響。由于在培養(yǎng)基浸提介質(zhì)中的胎牛血清和小牛血清在成分上存在一定差異，其在供試品毒性檢測上略有差異，但非顯著。購自Hatano研究所食品藥品安全中心的陰性對照材料表現(xiàn)出了良好的陰性結(jié)果，并且在本實驗室的重復測試中活力穩(wěn)定。