遼寧省醫(yī)療器械檢驗(yàn)檢測(cè)院 （遼寧沈陽(yáng) 110171）

內(nèi)容提要： 目的：建立醫(yī)用硅酮疤痕凝膠貼的微生物限度檢查方法。方法：根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版 四部），通過3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。結(jié)果：在對(duì)需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)方法驗(yàn)證的3次獨(dú)立平行試驗(yàn)中，供試液對(duì)照組的菌回收率均大于70%；在對(duì)控制菌檢查方法驗(yàn)證的3次獨(dú)立平行試驗(yàn)中，陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組檢出陽(yáng)性試驗(yàn)菌。結(jié)論：通過方法學(xué)驗(yàn)證說明建立的微生物限度檢查方法適用于醫(yī)用硅酮疤痕凝膠貼的微生物限度檢查，保證微生物限度檢查方法的有效性。

醫(yī)用硅酮凝膠具有改善疤痕表皮結(jié)構(gòu)的作用，減輕毛細(xì)血管充血和膠原纖維增生，改善疤痕組織代謝和營(yíng)養(yǎng)供給，從而防止增生性疤痕的形成。近年，在美容醫(yī)療產(chǎn)品中的應(yīng)用越來越多，如醫(yī)用硅酮疤痕凝膠貼、硅酮凝膠膏、硅酮凝膠噴霧劑等[1]。目前，對(duì)于硅酮疤痕凝膠貼的微生物限度檢查法鮮有報(bào)道，本文結(jié)合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》，建立了醫(yī)用硅酮疤痕凝膠貼微生物限度檢查的方法。

1.材料與方法

1.1 一般材料

儀器：集菌儀（HTY-2000A）（杭州高得醫(yī)療器械有限公司）；薄膜過濾器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）；多用生化培養(yǎng)箱（SP-530）（沈陽(yáng)市偉明醫(yī)療設(shè)備廠）；生物安全柜（HFsafe-1200）（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；全自動(dòng)立式滅菌鍋（LMQ.C-80C）（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；電子天平（XP2003S DR）（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

供試品：醫(yī)用硅酮疤痕凝膠貼，規(guī)格：8cm×6cm，批號(hào)：20180401，由企業(yè)提供。

實(shí)驗(yàn)菌種：銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]均來自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。

培養(yǎng)基及試劑：甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）、胰酪大豆胨瓊脂（TSA）、胰酪大豆胨肉湯（TSB）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂、吐溫80（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；生理鹽水（沈陽(yáng)志鷹藥業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 供試液制備

取供試品10g，放入90m生理鹽水（含0.05%吐溫80）中，振蕩30min，作為1:10的供試液備用。

1.2.2 菌液制備[2]

分別挑取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌適量，用生理鹽水稀釋至0～100cfu/mL的菌懸液。取黑曲霉適量，加含0.05%吐溫80的生理鹽水5mL，洗下黑曲霉孢子作為原液，用含0.05%吐溫80的生理鹽水稀釋至含菌數(shù)0～100cfu/mL的菌懸液。

1.2.3 采用薄膜過濾法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)

1.2.3.1 微生物限度計(jì)數(shù)適用性試驗(yàn)

需實(shí)驗(yàn)組操作：①氧菌總數(shù)：分別取供試液10mL，加到100m生理鹽水中，薄膜過濾，用生理鹽水300mL分次沖洗，100mL/次，在最后一次沖洗液中分別加入1mL（＜100cfu）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌。取出濾膜，菌面朝上貼于TSA上，33°C培養(yǎng)3d觀察結(jié)果。②霉菌和酵母菌總數(shù)：分別取供試液10mL，加到100m生理鹽水中，薄膜過濾，用生理鹽水300mL分次沖洗，100mL/次，在最后一次沖洗液中分別加入1mL（＜100cfu）白色念珠菌、黑曲霉菌。取出濾膜，菌面朝上貼于TSA上，23°C培養(yǎng)5d觀察結(jié)果。

菌液組：以稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入＜100cfu/mL的菌液1mL，方法同試驗(yàn)組。

供試液對(duì)照組：取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。

陰性對(duì)照組：取稀釋液10mL，按試驗(yàn)組操作，進(jìn)行相應(yīng)培養(yǎng)及計(jì)數(shù)。

微生物的回收率：回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試液對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組菌落數(shù)×100%。

1.2.3.2 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

根據(jù)產(chǎn)品技術(shù)要求，對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌進(jìn)行控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)。

金黃色葡萄球菌檢查：取供試液10mL，加到100m生理鹽水中，薄膜過濾，用生理鹽水300mL分次沖洗，100mL/次，取濾膜加入至100mLTSB培養(yǎng)基中，向其中加入＜100cfu的金黃色葡萄球菌，33°C培養(yǎng)24h。取上述培養(yǎng)物接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上，33°C培養(yǎng)24h。

銅綠假單胞菌檢查：取濾膜加入至100mLTSB培養(yǎng)基中，向其中加入＜100cfu的銅綠假單胞菌，33°C培養(yǎng)24h。取上述培養(yǎng)物接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基上，33°C培養(yǎng)24h。

陽(yáng)性對(duì)照組：取相應(yīng)菌液各1mL（＜100cfu），分別接種于100mL相應(yīng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)及檢查方法同試驗(yàn)組。

陰性對(duì)照組：取稀釋液10mL，分別接種于100mL相應(yīng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)及檢查方法同試驗(yàn)組。

供試液組：取制備好的供試液，不加菌液，同試驗(yàn)組操作。

所有驗(yàn)證均進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)。

2.結(jié)果

菌落計(jì)數(shù)及回收率測(cè)定三次獨(dú)立的平行試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表2. 控制菌檢查驗(yàn)證三次試驗(yàn)結(jié)果

表3. 樣品菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

表4. 樣品控制菌檢查結(jié)果

控制菌檢查驗(yàn)證三次獨(dú)立的平行試驗(yàn)結(jié)果見表2。

樣品菌落計(jì)數(shù)、控制菌檢查結(jié)果見表3、表4。

3.討論

對(duì)需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)方法驗(yàn)證的3次獨(dú)立平行試驗(yàn)中，供試液對(duì)照組的菌回收率均大于70%；在對(duì)控制菌檢查方法驗(yàn)證的3次獨(dú)立平行試驗(yàn)中，陰性對(duì)照組無(wú)菌檢出，實(shí)驗(yàn)組檢出陽(yáng)性試驗(yàn)菌，故可根據(jù)此方法測(cè)定醫(yī)用硅酮疤痕凝膠貼的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)和控制菌檢查。

伴隨中國(guó)藥典2015版的發(fā)布，對(duì)于微生物的檢驗(yàn)要求有了進(jìn)一步的提高，我國(guó)食品、藥品、醫(yī)療器械的微生物檢驗(yàn)、管理控制體系與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步接軌，微生物限度檢查的方法學(xué)建立是非常必要的。