王 敏,李 聰,舒 羽，李皓瑜,3,陳 邦,申燁華

(1.西北大學(xué) 合成與天然功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，西安 710127； 2.西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710127； 3.延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 延安 716000)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)屬毛茛科、芍藥屬植物，具有重要的觀賞、食用、藥用價(jià)值，頗受人們的喜愛和研究者的關(guān)注。油用牡丹籽中油脂含量占20%以上，油中不飽和脂肪酸含量大于90%，并富含牡丹皂苷、牡丹醇、牡丹酚以及維生素E等天然活性成分，具有抗氧化、抗癌、保護(hù)視力、預(yù)防心血管疾病、延緩衰老等醫(yī)療保健以及護(hù)膚美容等功效[1]，被稱為“液體黃金”。

油用牡丹籽粕作為榨油后的副產(chǎn)物含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖、多酚、黃酮等。其中，蛋白質(zhì)含量占籽粕質(zhì)量的20%～33%，是重要的天然植物蛋白來源[2]，也是制備活性多肽的優(yōu)良來源。徐玥等[3]采用堿溶酸沉法制備牡丹籽蛋白，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對牡丹籽蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明牡丹籽蛋白提取率可達(dá)78.23%±0.04%。宋艷秋[4]對堿溶酸沉法制備的牡丹籽蛋白進(jìn)行了理化性質(zhì)和動(dòng)物試驗(yàn)研究，結(jié)果表明牡丹籽蛋白具有較好的持水性、起泡性、乳化性和乳化穩(wěn)定性，且能夠滿足大鼠在生長發(fā)育過程中對蛋白質(zhì)和必需氨基酸的需求。顏輝等[5]比較了3種生物酶制備的牡丹籽蛋白酶解產(chǎn)物對血糖的抑制作用，結(jié)果表明，胰蛋白酶酶解產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果最佳，抑制率可達(dá)22.21%。

本課題組前期采用堿溶酸提法制備了油用牡丹籽粕蛋白，并以水解度為指標(biāo)對5種常用的蛋白酶進(jìn)行篩選，其中堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度和抗氧化活性最高，采用色譜和超濾技術(shù)相結(jié)合的方法對抗氧化多肽組分進(jìn)行分離純化，鑒定出5種新型的多肽序列，并研究了這5種新型抗氧化多肽的活性及結(jié)構(gòu)關(guān)系[6]。對于油用牡丹籽粕蛋白和堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的溶解度、變性溫度及溫度和pH對其抗氧化性的影響鮮有報(bào)道。本文以油用牡丹籽粕為原料，對牡丹籽粕蛋白及其堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布、溶解度、變性溫度及抗氧化穩(wěn)定性等進(jìn)行研究，以期為牡丹籽粕蛋白及其酶解產(chǎn)物的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

油用牡丹籽(品種鳳丹)去皮、經(jīng)冷榨法制油后得油用牡丹籽餅 (蛋白質(zhì)含量20.2%)，陜西興森源生物科技有限公司(陜西咸陽)提供；堿性蛋白酶(20 000 U/g)、牛血清白蛋白(98%)，生物純，優(yōu)博生物有限公司；G-250、R-250考馬斯亮藍(lán)，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；正己烷、95%乙醇、鹽酸、氫氧化鈉，分析純，西安三浦化學(xué)試劑。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JP-500C-8高速粉碎機(jī)，永康市久品工貿(mào)有限公司；ME204電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ) 循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器公司；UV-1780紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；Avanti J-26XP高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman公司；Q1000差示掃描量熱儀，美國TA公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牡丹籽粕蛋白(PoSMP)提取工藝流程

油用牡丹籽餅→粉碎→按質(zhì)量體積比1∶5加入正己烷脫脂→牡丹籽粕粉→按質(zhì)量體積比1∶10加入蒸餾水混勻→1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至10.0→攪拌4 h→離心收集上清液→1 mol/L鹽酸調(diào)pH為4.5→4℃靜置2 h→離心收集沉淀→調(diào)節(jié)至中性→冷凍干燥，得PoSMP。試驗(yàn)用Bradford法測定凍干粉中蛋白質(zhì)含量，首先以0～1.0 mg/mL的牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.919 6X+0.011 7(R2=0.999 2)，再根據(jù)曲線回歸方程計(jì)算得PoSMP中蛋白質(zhì)含量。根據(jù)以上方法得PoSMP的提取率為56.77%。

1.2.2 酶解產(chǎn)物(AHs)的制備

按1∶25(質(zhì)量體積比)的比例將PoSMP溶解于去離子水中，置于85℃預(yù)熱20 min。冷卻后調(diào)節(jié)pH和溫度到堿性蛋白酶最佳酶解條件 (pH為9.0，溫度為55℃)，隨后按照酶底比1∶25加入堿性蛋白酶，酶解6 h。酶解反應(yīng)期間用0.5 mol/L NaOH維持PoSMP酶解液的pH，記錄耗堿量。采用pH-stat法[7]測定水解度。酶解結(jié)束后，溶液于100℃保溫10 min使酶滅活。調(diào)節(jié)pH到中性，10 000 r/min離心10 min，取上清液，凍干得AHs。采用Lowry法[8]測定AHs中多肽含量以計(jì)算多肽得率。多肽得率=AHs中多肽質(zhì)量/牡丹籽粕蛋白質(zhì)量×100%。

1.2.3 SDS-PAGE測定相對分子質(zhì)量分布

采用SDS-PAGE法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布，試驗(yàn)分為制膠、跑膠、顯色、脫色4部分。制膠：采用20%的分離膠和5%的濃縮膠配制膠體。跑膠：將制備的PoSMP和AHs樣品配成2 mg/mL的溶液，按照1∶1比例加入上樣緩沖液后于沸水浴加熱5 min。冷卻至室溫，上樣10 μL，以80 mV電壓跑至分離膠后增至120 mV電壓至跑膠結(jié)束。顯色：0.5 g考馬斯亮藍(lán)R-250加入45 mL水、45 mL乙醇及10 mL冰乙酸混合制成染色液，染色30 min。脫色：以水-乙醇-冰乙酸(體積比9∶3∶1)為脫色液對膠進(jìn)行脫色。脫色后膠體在凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。

1.2.4 溶解度測定

以1∶100(質(zhì)量體積比)比例將PoSMP和AHs樣品分別溶解在蒸餾水中，用1.0 mol/L HCl或者1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為2.0～8.0。將樣品于室溫下靜置30 min后于6 500 r/min離心20 min。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Bradford法測量上清液蛋白質(zhì)含量(標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.764 7X-0.000 6,R2=0.997 5)，以pH為橫坐標(biāo)、溶解度為縱坐標(biāo)作圖。

1.2.5 變性溫度測定

準(zhǔn)確稱量5～20 mg凍干樣品于鋁盤中置于差示掃描量熱儀上，以5℃/min的速率由25℃升溫至130℃，以不加樣品的鋁盤為空白對照，測定PoSMP和AHs樣品的DSC曲線。以溫度為橫坐標(biāo)，熱流量為縱坐標(biāo)作圖，根據(jù)曲線得樣品的變性溫度和焓值。

1.2.6 抗氧化穩(wěn)定性測定

1.2.6.1 溫度對PoSMP和AHs抗氧化性的影響

以蒸餾水為溶劑，制備質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1.0 mg/mL的樣品溶液，隨后將樣品分別置于25、40、60、80℃和100℃的水浴中溫育30 min，隨后冷卻至室溫。采用ABTS自由基清除試驗(yàn)[9]評(píng)估溫度對PoSMP和AHs抗氧化性的影響。

1.2.6.2 pH對PoSMP和AHs抗氧化性的影響

用1 mol/L HCl(NaOH)將樣品溶液pH分別調(diào)至3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，25℃下反應(yīng)60 min后將溶液調(diào)回中性并將樣品溶液最終定容，以配成質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1.0 mg/mL的PoSMP和AHs樣品溶液。采用ABTS自由基清除試驗(yàn)[9]評(píng)估pH對PoSMP和AHs抗氧化性的影響。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

所有測量均重復(fù)3次。 所有結(jié)果均表示為3次重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。使用SPSS 19軟件，通過方差分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解蛋白

酶切反應(yīng)是制備多肽溶液高效且環(huán)保的方法，被廣泛使用。酶的種類決定酶切位點(diǎn)，對于某一種特定的蛋白質(zhì)而言，選取不同的水解酶會(huì)產(chǎn)生不同片段大小氨基酸組成的多肽序列，從而產(chǎn)生具有不同性質(zhì)和功能的酶解產(chǎn)物。本試驗(yàn)以PoSMP為底物，選擇堿性蛋白酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，以水解度考察酶切程度，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，經(jīng)堿性蛋白酶酶解PoSMP的水解度呈現(xiàn)先上升后趨于平緩的趨勢。酶解前1 h水解度迅速上升，達(dá)到(10.74±0.25)%，1～6 h水解度變化緩慢，6 h時(shí)水解度最大，達(dá)到(15.74±0.51)%，這可能是因?yàn)閴A性蛋白酶屬于外切酶，剛開始加入酶時(shí)，酶活大，反應(yīng)迅速。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶活不斷下降，酶切位點(diǎn)也在不斷減少，2 h后PoSMP溶液的水解度趨于平緩。此外，經(jīng)過酶切反應(yīng)獲得的堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物AHs多肽得率為73.25%。

圖1 牡丹籽粕蛋白的水解度隨時(shí)間的變化曲線

2.2 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布

為考察PoSMP和AHs的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布，進(jìn)行了SDS-PAGE試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

注：1.Marker；2.PoSMP；3.AHs。圖2 PoSMP和AHs的相對分子質(zhì)量分布

由圖2可知，PoSMP的亞基主要分布在62、45、34 kDa以及23 kDa附近，AHs的蛋白條帶則分布相對集中，含量較高的多肽片段集中在23、15 kDa和10 kDa，其中PoSMP和AHs中一些小肽類物質(zhì)可能會(huì)隨著電泳過程遷移出膠體。對泳道2、3列比較可知，堿性蛋白酶能夠?qū)oSMP中62、34 kDa附近的蛋白條帶水解為小于20 kDa的蛋白，酶解產(chǎn)物主要集中在10～15 kDa。但是堿性蛋白酶對45 kDa和23 kDa處蛋白條帶均未表現(xiàn)出水解作用，說明這兩處的蛋白條帶對堿性蛋白酶具有較好的耐受性，對于其性質(zhì)的研究需要進(jìn)一步探討。

2.3 PoSMP和AHs的溶解度

試驗(yàn)對PoSMP和AHs的溶解度進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，PoSMP和 AHs的溶解度在pH 2.0～8.0內(nèi)均表現(xiàn)出先下降再上升后趨于平緩的趨勢。其中PoSMP在pH為4.5時(shí)的溶解度最低，為(0.92±0.25)%，在pH小于3.0和pH大于6.0條件下，溶解度均大于60%，表現(xiàn)出良好的溶解性。PoSMP在pH為7.0時(shí)溶解度為(71.83±3.28)%，高于米糠蛋白最大溶解度64.30%(pH為7.0)[10]，該性質(zhì)與不同蛋白樣品的相對分子質(zhì)量大小和結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系。AHs的溶解度在pH為3.7時(shí)最小，為(8.90±0.32)%，且pH大于6.0的環(huán)境中幾乎可溶。AHs在中性條件下的溶解度為(89.73±5.62)%，與相同條件下大米蛋白酶解產(chǎn)物的溶解度(85.8%)類似[11]。此外，當(dāng)pH在2.0～4.2時(shí)，PoSMP比AHs的溶解度高，而當(dāng) pH大于4.2時(shí)，AHs的溶解度高于PoSMP，這與兩者含有的親/疏水性氨基酸含量密切相關(guān)。

不一樣的學(xué)生，智力因素與非智力因素是存在差異的，這就導(dǎo)致學(xué)生對于所學(xué)內(nèi)容的學(xué)習(xí)能力是不一致的。特別是高中政治，因?yàn)閷W(xué)科自身的特征，學(xué)生常常感到無聊、乏味，學(xué)生的學(xué)習(xí)水平也就因此產(chǎn)生了不同的等次。這就需要教師在編排微課內(nèi)容時(shí)，一定要考慮到不同層次學(xué)生的自身能力，根據(jù)學(xué)生的情況編排同一水平的內(nèi)容，以激發(fā)各個(gè)層次學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和學(xué)習(xí)自主性。

圖3 PoSMP和AHs的溶解度曲線

2.4 PoSMP和AHs的變性溫度

蛋白質(zhì)的功能活性是建立在其構(gòu)象完整的基礎(chǔ)上，在蛋白類食品加工過程中處理溫度過高會(huì)導(dǎo)致蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化從而影響其活性，所以對蛋白類物質(zhì)變性溫度的研究具有重要意義。PoSMP和AHs的變性溫度曲線如圖4所示。

圖4 PoSMP(A)和AHs(B)的變性溫度曲線

由圖4(A)可知，采用堿溶酸沉法制備的PoSMP在25～130℃的升溫過程中處于緩慢吸熱狀態(tài)，直到67.82℃時(shí)出現(xiàn)最低吸熱變性峰，且測定的焓值為124.0 J/g。PoSMP的變性溫度接近燕麥麩皮蛋白(66.28℃)[12]，低于黑米蛋白的變性溫度(87.35℃)[13]。由圖4(B)可知，AHs的變性溫度為84.70℃，焓值為185.3 J/g。與PoSMP相比，AHs的變性溫度和焓值都升高，焓值越大說明樣品中含有的有序結(jié)構(gòu)越多，且變性的程度越小。PoSMP經(jīng)過酶切后的產(chǎn)物(AHs)多為一級(jí)結(jié)構(gòu)的小分子多肽片段，二維或者三維結(jié)構(gòu)的蛋白分子占比較少，所以整個(gè)酶解體系受溫度的影響較蛋白小。

2.5 抗氧化穩(wěn)定性

2.5.1 溫度、pH對PoSMP抗氧化性的影響

ABTS自由基清除能力是抗氧化性的重要指標(biāo)之一，可以有效地闡明樣品的抗氧化性受外界環(huán)境的影響。因此，試驗(yàn)選取ABTS自由基清除活性作為指標(biāo)，考察了質(zhì)量濃度0.25、0.5、1.0 mg/mL的PoSMP在不同溫度和不同pH下的抗氧化性，結(jié)果見圖5。

圖5 溫度(A)和pH(B)對PoSMP抗氧化性的影響

由圖5(A)可知，在3種不同PoSMP質(zhì)量濃度下，隨著溫度的升高，PoSMP的ABTS自由基清除活性均表現(xiàn)出上升的趨勢。溫度高于80℃時(shí)，PoSMP的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生一定的改變。但是，根據(jù)自由基清除原理中的電子轉(zhuǎn)移原理和氫原子轉(zhuǎn)移原理可知，ABTS自由基清除活性與蛋白質(zhì)的三維及以上結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)較小[14-15]。所以在高溫環(huán)境下ABTS自由基清除活性仍會(huì)提高，質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1.0 mg/mL的PoSMP在100℃時(shí)ABTS自由基清除活性分別為(31.09±1.05)%、(51.54±1.09)%、(82.87±0.73)%。由圖5(B)可知，PoSMP在pH小于9.0的環(huán)境下ABTS自由基清除活性幾乎不發(fā)生變化，但是ABTS自由基清除活性在強(qiáng)堿性條件下具有下降的趨勢，且質(zhì)量濃度越高影響越大。pH為7.0和11.0時(shí)，1.0 mg/mL PoSMP樣品的ABTS自由基清除活性分別為(78.27±1.65)%和(73.54±3.01)%。

2.5.2 溫度、pH對AHs抗氧化性的影響

試驗(yàn)以ABTS自由基清除活性作為指標(biāo)，考察了質(zhì)量濃度0.25、0.5、1.0 mg/mL的AHs在不同溫度、不同pH下的抗氧化性，結(jié)果見圖6。

圖6 溫度(A)和pH(B)對AHs抗氧化性的影響

由圖6(A)可知，在3個(gè)質(zhì)量濃度下，隨著溫度的升高，AHs的ABTS自由基清除活性表現(xiàn)相同的趨勢，該趨勢與PoSMP隨溫度的變化相似。由圖6(B)可知，pH為11.0時(shí)AHs在0.25 mg/mL質(zhì)量濃度下的ABTS自由基清除活性((37.68±0.65)%)較pH為7.0時(shí)((39.26±0.90)%)幾乎保持平衡，0.5 mg/mL和1.0 mg/mL時(shí)表現(xiàn)出相同的趨勢。試驗(yàn)表明AHs具有良好的耐高溫和耐酸堿的特性。

3 結(jié) 論

本文研究了油用牡丹籽粕蛋白(PoSMP)及其堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物(AHs)的相對分子質(zhì)量分布以及功能特性。采用堿性蛋白酶對PoSMP酶解6 h水解度達(dá)(15.74±0.51)%。功能特性試驗(yàn)表明PoSMP和AHs樣品在中性條件下溶解度可達(dá)(71.83±3.28)%和(89.73±5.62)%，且PoSMP的溶解度高于文獻(xiàn)報(bào)道的米糠蛋白溶解度。PoSMP和AHs變性溫度分別為67.82℃和84.70℃。此外，在質(zhì)量濃度0.25、0.5、1.0 mg/mL時(shí)，PoSMP在高溫和pH為3.0～9.0范圍顯示較強(qiáng)的抗氧化性，AHs在高溫及強(qiáng)堿性pH 11.0環(huán)境下對ABTS自由基清除活性幾乎無影響。因此，從油用牡丹籽粕中制備的PoSMP和AHs在食品中具有潛在的應(yīng)用，有望作為功能性成分或補(bǔ)充劑添加到特醫(yī)食品、保健品等產(chǎn)品中。