高振華,王超然,郭秀潔,王紀(jì)霞,郭志謀,王聯(lián)芝
1湖北民族大學(xué),恩施 44500;2中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,大連 116023;3中科院大化所中國醫(yī)藥城生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院,泰州 225300
延胡索為罌粟科紫堇屬植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖,別名元胡、延胡、玄胡索、元胡索等,是傳統(tǒng)的“浙八味”之一[1,2]。作為一味應(yīng)用歷史悠久的活血、行氣、止痛中藥,其療效一直為歷代醫(yī)家推崇,目前也仍廣泛應(yīng)用于治療心律失常、氣虛瘀滯、胸痹心痛、脘腹疼痛、產(chǎn)后瘀滯腹痛、跌打損傷等,是中藥復(fù)方制劑中的常用藥[3,4]。
現(xiàn)代研究表明,延胡索中主要活性成分為生物堿,其中以叔胺型的原小檗堿類和季銨型的小檗堿類含量最高,占比可分別達(dá)到0.65%和0.3%左右[5-7]。這兩類成分骨架結(jié)構(gòu)非常類似,但生物學(xué)效應(yīng)大不相同。藥理學(xué)研究表明,延胡索的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠和安定等作用主要與水溶性極差的叔胺型生物堿相關(guān)[8,9],其中以乙素、丑素最強(qiáng),甲素次之,雖然都比嗎啡弱,但其作用受體為多巴胺受體,沒有成癮性缺陷,耐藥性也優(yōu)于嗎啡。相比之下,延胡索中的季銨堿成分,在鎮(zhèn)痛方面發(fā)現(xiàn)較少,但在抗心肌缺血、較少心肌耗氧等方面具有更顯著的作用[10-12]。
延胡索中叔胺堿和季銨堿的不同作用靶點(diǎn)和功效,提示了分別以叔胺堿和季銨堿類組分開發(fā)活性部位制劑將使藥效作用機(jī)制更加清晰,在治療具體疾病時(shí)更有針對(duì)性,具有中藥5類新藥的開發(fā)前景,而目前對(duì)延胡索作用機(jī)制和制劑產(chǎn)品的研究仍主要以總堿為主[13,14],成分較復(fù)雜,往往難以有效闡明療效物質(zhì)基礎(chǔ)。也有部分研究工作采用樹脂層析或酸堿萃取的方式,得到了延胡索叔胺堿或季銨堿的組分,但總體工藝穩(wěn)定性較差,酸堿廢液量大,難以符合現(xiàn)代的環(huán)保生產(chǎn)要求,得到的組分純度也不高[15,16]。在前期分離純化延胡索生物堿單體的過程中,我們也發(fā)現(xiàn)這兩類成分在色譜填料上的色譜峰形和保留行為具有很大差異,將其采用C18WCX實(shí)現(xiàn)類組分分離后,分別采用C18和C18SCX來制備叔胺堿和季銨堿單體,可以使兩類成分在不同的分離方法中獲得良好的色譜峰形和載樣量,從而降低純化制備的難度[17]。因此,發(fā)展高效的延胡索生物堿類組分制備方法,不僅對(duì)延胡索類組分制劑的開發(fā)具有重要作用,對(duì)生物堿單體的制備,深入研究延胡索的組成成分也能帶來很大的便利。
為克服使用C18WCX填料進(jìn)行類組分制備過程中載樣量不易控制,填料比較小眾不易產(chǎn)業(yè)化等缺點(diǎn),本文采用普通C18填料,利用延胡索叔胺堿和季銨堿在不同pH值條件下電荷性質(zhì)不同的特點(diǎn),發(fā)展了一種更為簡(jiǎn)便易行的延胡索類組分高效制備方法,并對(duì)得到的兩類組分進(jìn)行了生物堿含量測(cè)定和多巴胺D2受體拮抗活性的驗(yàn)證,結(jié)果顯示,兩類成分在新方法中得到了有效分離,且類組分的生物堿含量以已知對(duì)照品計(jì)分別達(dá)到了84.0%和60.7%,符合有效部位中藥制劑的開發(fā)要求,延胡索提取物的多巴胺D2受體拮抗活性也集中在了叔胺堿組分中,可為相應(yīng)的類組分新藥制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)儀器:Alliance e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)包括自動(dòng)進(jìn)樣器,2695型分離單元,柱溫箱系統(tǒng),2996型光電二極管陣列檢測(cè)器和 Empower 色譜工作站。YJD20D-GL十功能自動(dòng)煎藥機(jī)(北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司)、LX-0400型20 L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司)、CeraMem0100-015型500 nm陶瓷膜(廈門福美科技有限公司)、DAC-50動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱(江蘇漢邦科技有限公司)、PUERLAB Chorus實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)(英國ELGA公司)、FLIPR Tetra 高通量實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)(美國Molecular Devices公司)、SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。
使用的色譜柱:Kromasil 100-5-C18柱(4.6×150 mm,5 μm,Kromasil,瑞典);C18柱(4.6×250 mm,10 μm,大連思譜,大連)。
延胡索藥材樣品(產(chǎn)自浙江金華)。乙腈、乙醇、醋酸、醋酸銨均為分析純(購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、多巴胺、氟哌啶醇(購自梯希愛上海仁成工業(yè)發(fā)展有限公司)、制備乙醇(購自上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?。所使用的對(duì)照品(1∶1,3-甲基去氫紫堇達(dá)明堿;2:去氫紫堇球堿;3:巴馬??;4:去氫紫堇堿;5:海罌粟堿;6:延胡索乙素;7:延胡索甲素.)均為實(shí)驗(yàn)室自制,HPLC檢測(cè)純度為95%以上。制備實(shí)驗(yàn)所使用的C18填料購自大連思譜精工有限公司,粒徑10 μm,孔徑10 nm。固相萃取實(shí)驗(yàn)所使用的C18CEX填料購自大連思譜精工有限公司,粒徑40 μm,孔徑10 nm。
1.2.1 延胡索生物堿提取物制備
取延胡索干燥樣品500 g,放入十功能自動(dòng)煎藥機(jī),第一次提取加入70%乙醇水溶液5 L,提取溫度80 ℃,沸騰后煎煮60 min,第二次提取加入70%乙醇水溶液5 L,溫度80 ℃,沸騰后煎煮40 min,合并兩次提取液。用20 L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮去除乙醇至1.6 L后,使用500 nm陶瓷膜進(jìn)行澄清過濾,收集透過液,至循環(huán)端液體體積降低至200~300 mL后,加0.8 L純化水進(jìn)行洗濾,合并膜透過液,得到延胡索澄清透過液1.80 L,旋蒸濃縮至180 mL,取2.0 mL樣品凍干得固體0.245 g,測(cè)得其固含量為122.5 g/L,總提物為22.05 g。
1.2.2 延胡索生物堿提取物樣品分析和類組分制備方法開發(fā)
樣品分析:Kromasil 100-5-C18(5 μm,4.6×150 mm)色譜柱,流動(dòng)相A相為乙腈,B相為0.1%磷酸(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.0)或0.1 mol/L醋酸銨(加醋酸調(diào)節(jié)pH值為6.0、6.5、6.8),C相為純水,梯度洗脫條件:0~20 min,23% A;20~30 min,23%→55% A;30~50 min,55% A;B相固定20%。檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,流速1 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,柱溫30 ℃。
類組分制備方法開發(fā):C18(10 μm,4.6×250 mm)色譜柱,流動(dòng)相A為乙醇,B為20 mmol醋酸銨(pH值為6.8),梯度洗脫條件:0~20 min,23% A;20~30 min,23%←55% A;30~50 min,55% A。臺(tái)階等度洗脫條件:0~30 min,23%A;30~30.1 min,23%~55%A;30.1~50 min,55%A。檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,流速0.6 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,柱溫30 ℃。
1.2.3 延胡索類組分制備
制備柱為DAC-50 mm動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱,填裝C18(10 μm,大連思譜,大連)填料300 g,流動(dòng)相A為乙醇,B為20 mmol醋酸銨(pH值為6.8),梯度洗脫條件:0~30 min,23%A;30~30.1 min,23%→55%A;30.1~50 min,55%A。檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,流速70 mL/min。
1.2.4 延胡索類組分含量測(cè)定
對(duì)照品溶液的配制:使用十萬分之一天平,準(zhǔn)確稱取延胡索乙素、延胡索甲素和海罌粟堿各10 mg,使用含0.1%甲酸的50%甲醇進(jìn)行溶解,配制成一系列梯度的叔胺堿混合對(duì)照品溶液,另稱取去氫紫堇堿、巴馬汀、去氫紫堇球堿、1,3-甲基去氫紫堇達(dá)明堿各10 mg,使用含0.1%甲酸的50%甲醇進(jìn)行溶解,配制成一系列梯度的季銨堿混合對(duì)照品溶液。以混合對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,叔胺堿混合標(biāo)準(zhǔn)品在3.2~2 000 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999 7,季銨堿混合標(biāo)準(zhǔn)品在40~1 000 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999 9。
延胡索類組分供試品制備:稱取類組分制備得到的叔胺堿和季銨堿類組分凍干粉末各10 mg,使用50%甲醇水溶液超聲溶解后于10 mL容量瓶中定容,配置成1 mg/mL的叔胺堿及季銨堿類組分供試品溶液。
1.2.5 鎮(zhèn)痛活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)條件
將延胡索提取物及類組分樣品取樣,在表達(dá)多巴胺D2受體的細(xì)胞人胚腎293T細(xì)胞(HEK293T)上,采用FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader,Molecular Device Corp)進(jìn)行活性篩選,樣品終濃度為50 μg/mL。以每孔80 000個(gè)細(xì)胞接種于用poly-D-lysine涂層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,24 h后除去培養(yǎng)基并于每孔中加入100 μL熒光染料溶液(calcium-6)在37 °C下恒溫1 h時(shí),除去染料溶液并于每孔加入100 μL 0.5% amaranth,將待測(cè)樣品用二甲基亞砜(DMSO)溶解后置于96孔板中,采用FLIPR進(jìn)行自動(dòng)加樣與細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育10 min后在520和488 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光檢測(cè)從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
參考文獻(xiàn)方法[18,19],我們首先以乙腈和磷酸三乙胺緩沖鹽(pH 6.0)為流動(dòng)相對(duì)延胡索提取物進(jìn)行了分析。結(jié)果如圖2a所示,延胡索主要生物堿成分都得到了較好的分離,20 min以后峰色譜峰峰形良好,但5~20 min區(qū)域的色譜峰均較拖尾。通過DAD檢測(cè)器的色譜峰紫外光譜圖分析可知(如圖3所示),峰1~6均具有季銨型小檗堿類生物堿的特征吸收,而峰8~12均為叔胺型原小檗堿類生物堿的特征吸收,峰7為海罌粟堿為阿樸啡類生物堿的特征吸收。通過與實(shí)驗(yàn)室前期自制的標(biāo)品對(duì)比,2、3、4、6號(hào)峰分別為1,3-甲基去氫紫堇達(dá)明堿、去氫紫堇球堿、巴馬汀、去氫紫堇堿(均為季銨堿),峰9、12分別為延胡索乙素、延胡索甲素,峰7為海罌粟堿(均為叔胺堿),也證實(shí)兩類成分在接近中性的流動(dòng)相體系下,色譜保留時(shí)間存在較大差異,能夠?qū)崿F(xiàn)兩類組分的良好分離。在該pH條件下,堿性較弱的叔胺堿電離已經(jīng)得到大部分抑制,主要呈分子態(tài),保留較強(qiáng),色譜峰形也較好,而季銨堿永久帶電荷,呈離子狀態(tài),因而保留總體弱于叔胺堿。
磷酸三乙胺不易揮發(fā),且在后續(xù)工業(yè)生產(chǎn)中無法用膜分離回收套用,為便于后續(xù)的液質(zhì)聯(lián)用分析和工業(yè)化制備應(yīng)用,我們嘗試用中性的醋酸銨代替磷酸三乙胺。如圖2b所示,0.1 mol/L 醋酸銨(pH 6.8)條件下,叔胺堿與季銨堿同樣可以實(shí)現(xiàn)良好的分離,且具有鎮(zhèn)痛活性的海罌粟堿與叔胺堿更為接近,可將其歸入叔胺堿類組分。但海罌粟堿與8號(hào)峰的保留過于接近,不利于含量分析,經(jīng)pH微調(diào),發(fā)現(xiàn)pH為6.5時(shí),7號(hào)峰海罌粟堿能與周邊峰得到更好的分離,故選擇pH6.5為分析條件,而在類組分制備時(shí)可選擇pH6.8。
在傳統(tǒng)方法中,常使用大孔吸附樹脂對(duì)延胡索生物堿成分純化分離,但是大孔吸附樹脂對(duì)溶劑需求量大,樣品分離過程緩慢,且大孔吸附樹脂再生復(fù)雜,不適合大量樣品的分離制備[20]。制備色譜通常使用10 μm以上的填料,且優(yōu)先使用甲醇、乙醇等易于納濾回收且價(jià)格相對(duì)低廉的有機(jī)溶劑,以節(jié)約溶劑的使用成本。本實(shí)驗(yàn)采用了10 μm的C18填料,先使用4.6×250 mm的預(yù)裝柱上進(jìn)行溶劑和梯度方法考察。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在乙醇/醋酸銨(pH 6.8)體系下,采用相同的梯度條件,延胡索提取物中的季銨堿雖然峰形更為拖尾,但與叔胺堿的類分離由于叔胺堿的保留增強(qiáng),類分離效果更優(yōu)(如圖4a所示),這也可能是制備填料與分析柱填料選擇性略有差異導(dǎo)致。為便于生產(chǎn)制備,將梯度條件簡(jiǎn)化為23%乙醇和55%乙醇兩個(gè)臺(tái)階梯度,分別用于洗脫季銨堿和叔胺堿??紤]到圖4a中20 min 23%的乙醇還不能把季銨洗脫完全,因此把季銨堿的洗脫時(shí)間延長(zhǎng)到30 min,結(jié)果如圖4b所示,叔胺堿和季銨堿的分離度進(jìn)一步擴(kuò)大。
圖1 延胡索中主要的叔胺堿和季銨堿Fig.1 Structures of main tertiary and quaternary alkaloids in Rhizoma Corydalis
圖2 延胡索提取物在不同緩沖鹽條件下的分離譜圖Fig.2 Separation chromatogram of Rhizoma Corydalis extracts with different buffer salt 注:流動(dòng)相添加劑:(a)0.1%磷酸三乙胺;(b~d)0.1 mol/L醋酸銨,pH值分別為6.8、6.5、6.0。洗脫梯度(a):0~20 min,23% A;20~30 min,23%→55% A;30~50 min,55% A;洗脫梯度(b~d):0~20 min,23% A;20~30 min,23%→55% A;30~50 min,55% A,緩沖鹽相固定20%。色譜峰:叔胺堿:7.海罌粟堿;9.延胡索乙素;12.延胡索甲素;季銨堿:2.1,3-甲基去氫紫堇達(dá)明堿;3.去氫紫堇球堿;4.巴馬??;6.去氫紫堇堿。Note:Additives:(a) 0.1% triethylammonium phosphate;(b-d) 0.1 mol/L ammonium acetate with pH at 6.8,6.5,6.0 respectively.gradient(a):0-20 min,23%A;20-30 min,23%→55%A;30-50 min,55%A.gradient(b-d):0-20 min,23%A;20-30 min,23%→55%A;30-50 min,55%A,buffer salt phase fixed at 20%.Peaks:Tertiary alkaloids:7.Glaucine;9.Tetrahydropalmatine;12.Corydaline;Quaternary alkaloids:2.1,3-Methyldehdrocorydalmine;3.Dehydrocorybulbine;4.Palmatine;6.Dehydrocorydaline.
圖3 延胡索提取物主要色譜峰的紫外吸收譜圖Fig.3 Ultraviolet spectra of main chromatographic peaks of Corydalis extracts
圖4 乙醇/醋酸銨體系梯度及臺(tái)階等度色譜圖Fig.4 Gradient and step equivalent chromatography of ethanol/ammonium acetate system
在選定的流動(dòng)相條件下,將方法轉(zhuǎn)移至裝填有300 g相同C18填料的DAC-50 mm制備柱上進(jìn)行放大。經(jīng)簡(jiǎn)單摸索,樣品上樣量為80 mL(含固體9.8 g,相當(dāng)于填料量3.3%)時(shí)的制備譜圖如圖5所示:
圖5 延胡索類組分制備液相色譜圖Fig.5 Preparative chromatogram of Rhizoma Corydalis class separation
分別收集10~20 min和34~50 min的餾分,進(jìn)行HPLC分析,分析結(jié)果如圖6所示,可以看到兩類組分實(shí)現(xiàn)了良好的分離,兩類生物堿之間無成分交叉。從制備譜圖和分析結(jié)果看,樣品載樣量還有比較大的提升空間,但本次實(shí)驗(yàn)因?yàn)樘崛∥飿悠妨坑邢?,上樣量先增加到了填料量?.3%,在工業(yè)化生產(chǎn)過程中樣品載樣量可以繼續(xù)增大,適用于大規(guī)模樣品的生產(chǎn)制備。
圖6 制備餾分分析色譜圖Fig.6 Analytical chromatograms of preparative fractions
上述制備方法制得的延胡索類組分含有醋酸銨緩沖鹽,在工業(yè)生產(chǎn)中,可使用納濾膜濃縮,實(shí)現(xiàn)溶劑回收套用,但本次小試的樣品量較少,采用固相萃取(SPE)的方式進(jìn)行同步脫鹽和濃縮。實(shí)驗(yàn)使用一種耐純水的親水性反相填料C18CEX作為SPE固定相,將類組分制備所得餾分經(jīng)旋蒸濃縮除去乙醇后,分別上樣至兩個(gè)活化平衡好的20 g裝SPE柱,水洗3倍柱體積脫鹽后,甲醇洗脫,旋蒸,凍干得到固體粉末,其中季銨堿固體粉末0.68 g ,叔胺堿固體粉末1.00 g。
按前述分析方法,以實(shí)驗(yàn)室自制的7個(gè)已知成分為對(duì)照品,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)所制得的類組分進(jìn)行含量測(cè)定。計(jì)算結(jié)果顯示,在叔胺堿類組分中延胡索乙素含量21.0%,延胡索甲素含量21.0%,海罌粟堿含量42.0%,以該3個(gè)主要已知叔胺堿計(jì),叔胺型類組分的生物堿含量達(dá)84.0%,而在季銨堿類組分中去氫紫堇堿含量37.0%,巴馬汀含量7.7%,去氫紫堇球堿含量5.5%,1,3-甲基去氫紫堇達(dá)明堿含量10.5%,以這4種已知對(duì)照品計(jì),該類組分種含已知成分的含量達(dá)60.7%,兩個(gè)類組分的已知成分含量總和均超過50%,符合中藥有效部位制劑的已知成分含量大于50%的要求。
圖7 延胡索類組分含量測(cè)定Fig.7 Determination of class components in Rhizoma Corydalis
圖8 延胡索組分D2受體拮抗活性測(cè)試Fig.8 Antagonist activity of Rhizoma Corydalis fractions on D2 receptor注:與陰性對(duì)照組(buffer+dopamine)比較,**P < 0.01。Note:Compared with negative control group (buffer+dopamine),**P < 0.01.
圖9 不同濃度叔胺堿拮抗活性Fig.9 Antagonistic activity of different concentrations of tertiary alkaloid注:濃度1~3分別為50.00、1.85、0.07 μg/mL。Note:Concentration 1-3 were 50.00,1.85,0.07 μg/mL,respectively.
現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,延胡索的鎮(zhèn)痛、安定作用是通過多巴胺受體系統(tǒng)發(fā)揮作用的,尤其是對(duì)多巴胺D2受體的拮抗作用[21]。將制備的季銨堿和叔胺堿類組分與延胡索提取物在Fliper實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上進(jìn)行了多巴胺D2拮抗作用的活性對(duì)比,結(jié)果如圖8所示,延胡索提取物對(duì)多巴胺D2受體有顯著拮抗作用,其作用強(qiáng)度與陰性對(duì)照組(dopamine)相比具有顯著性差異,且大于陽性對(duì)照氟哌啶醇(haloperidol),制備成類組分后,季銨堿類組分的拮抗活性較弱,而叔胺堿的活性強(qiáng)于提取物,這也證明了兩類組分在藥理活性上的差異。叔胺堿組分在不同濃度下都具有拮抗活性,如圖9所示,對(duì)叔胺堿樣品進(jìn)行稀釋并測(cè)定其拮抗活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度降低至1.85 μg/mL時(shí),叔胺堿組分達(dá)到最低抑制濃度,拮抗活性明顯,繼續(xù)降低濃度直至0.07 μg/mL時(shí),拮抗活性明顯降低,證明了叔胺堿組分的拮抗活性具有劑量依賴性,這些結(jié)果為更有治療針對(duì)性的有效部位制劑開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。
延胡索中叔胺堿和季銨堿兩類生物堿在電離狀態(tài)下保留接近難以區(qū)分,但隨著流動(dòng)相pH值升高,叔胺堿的電離更易受到抑制,保留時(shí)間顯著增強(qiáng),能與季銨堿組分實(shí)現(xiàn)有效分離,從而開發(fā)了一種簡(jiǎn)便的類組分分離方法。通過分離制備得到了兩類成分區(qū)分明晰、含量較高,且具有不同藥理活性的生物堿類組分,通過多巴胺D2受體的拮抗活性測(cè)試,也進(jìn)一步證實(shí)延胡索的鎮(zhèn)痛相關(guān)活性物質(zhì)主要集中在叔胺堿類組分。這些結(jié)果為延胡索生物堿化學(xué)成分研究和具有針對(duì)性治療作用的有效部位制劑開發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。