黃艷麗，尹錦榮，王 瓊，虞志君，袁其敏，楊超凡，趙 秀

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，云南 普洱 665000）

多依果（Docynia delavayi fruit）又稱栘衣果、酸蘋果，是薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）栘[木衣]屬（Docynia）熱帶經(jīng)濟(jì)作物云南栘（Docynia delavayi（Franch.）Schneid.）的果實(shí)。云南栘主要分布于亞洲，在我國(guó)產(chǎn)于云南、貴州、四川等西南各地[1-2]。多依營(yíng)養(yǎng)豐富，食藥兩用[3]，其富含多種氨基酸，具有健胃消食和抗疲勞的作用[4-5]；且其還是一味傣藥，含有黃酮類[6-13]、多酚類[14-15]等活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化和治療心血管病的藥用價(jià)值[16]。多依果是云南省極具地方特色的熱帶水果，當(dāng)?shù)厝舜罅坎烧秤?，栘依產(chǎn)業(yè)對(duì)提高山區(qū)農(nóng)民收入和生活水平具有重要的意義。

多依果中粗纖維和植物單寧含量較高，生吃時(shí)質(zhì)地酸澀[15]，使得外地受眾較少，因而造成了多依果資源的大量浪費(fèi)。目前，受限于地域環(huán)境特征，關(guān)于多依果產(chǎn)品的研究開發(fā)，報(bào)道較少[17]。朱明君等[18]通過人工接種冠突散囊菌（Eurotium cristatum）固態(tài)發(fā)酵多依果茶飲料，并研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后果茶的呈味氨基酸和人體必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，這表明通過發(fā)酵可以改變多依果鮮果的粗渣口感；冀智勇等[19-20]對(duì)多依果的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了研究，并在此基礎(chǔ)上介紹了多依腌制果、果醬、果脯、果角、果片、果飲料、果醋、果酒的粗加工工藝，但加工方法簡(jiǎn)單，且沒有對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。多依果在民間的酒釀歷史悠久，但受到技術(shù)水平的限制，風(fēng)味口感各異，難以大規(guī)模推廣。因此，研究多依果酒的釀造工藝并加以科學(xué)優(yōu)化，既可以將多依果的營(yíng)養(yǎng)成分保存到果酒中，豐富果酒品種，又可充分利用多依果的野生資源，進(jìn)而推動(dòng)多依果產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展。

酵母菌生長(zhǎng)繁殖的適宜溫度為20～25 ℃左右。受亞熱帶季風(fēng)氣候影響，多依果主產(chǎn)地普洱市四季如春，在10～12月份多依果成熟采摘期時(shí)日溫差約為18～26 ℃，因此，當(dāng)?shù)囟嘁拦漆勚贫噙x擇自然溫度發(fā)酵。本研究以多依果為原料，室溫（18～26 ℃）發(fā)酵多依果酒，以酒精度、可溶性固形物含量及感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化多依果酒的釀造工藝參數(shù)，旨在釀造一款具有多依果典型香氣和富含其多種營(yíng)養(yǎng)成分的果酒，為多依果產(chǎn)品的開發(fā)以及多依果酒的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多依果（黃熟期）：云南普洱農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；安琪果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（10 000 U/mL）：諾維信生物有限公司；白砂糖（食品級(jí)）：深圳安泰生物科技有限公司；焦亞硫酸鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E分析天平：美國(guó)METTLER TLLEDO公司；HC-3618R高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳公司；LH-B55數(shù)顯折光儀：杭州陸恒生物科技有限公司；PB-10酸度計(jì)：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；GMK-702R糖度測(cè)定儀：北京西諾遠(yuǎn)大科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多依果酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

原料預(yù)處理：挑選無病蟲害、無霉變、無破損的黃熟期多依果，洗凈，晾干。

切塊、打漿：鮮果稱質(zhì)量，切塊，按料液比2∶1（g∶mL）加水，混合打漿。

酶解：添加0.2%的果膠酶于果漿中，室溫酶解6 h。

糖度調(diào)整：添加試驗(yàn)所需白砂糖量，以達(dá)到果酒發(fā)酵所需的酒精度要求。

殺菌：添加試驗(yàn)所需的二氧化硫進(jìn)行滅菌。

酵母活化：稱取試驗(yàn)所需酵母菌用量，加入5 mL無菌水，在35 ℃條件下水浴活化30 min，備用。

接種發(fā)酵：將活化后的酵母液接入到發(fā)酵罐中酶解后的果漿中，室溫發(fā)酵，并且定期攪拌排氣。

過濾、陳釀：發(fā)酵液紗布過濾，酒液密封陳釀1～2個(gè)月，得多依果酒。

1.3.2 多依果酒釀造工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定初始發(fā)酵條件為白砂糖添加量24%、二氧化硫添加量6%、酵母菌添加量3%，室溫（日溫差18～26 ℃）發(fā)酵7 d。在此基礎(chǔ)上，分別改變白砂糖添加量（20%、22%、24%、26%、28%）、二氧化硫添加量（4%、5%、6%、7%、8%）、酵母菌接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵時(shí)間（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d），測(cè)定多依果發(fā)酵液的酒精度及可溶性固形物含量，并進(jìn)行感官評(píng)定。

1.3.3 多依果酒釀造工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定發(fā)酵時(shí)間為6 d，選取對(duì)多依果發(fā)酵液酒精度、感官評(píng)分具有顯著性影響的因子白砂糖添加量（A）、二氧化硫添加量（B）和酵母菌接種量（C）作為考察因素，酒精度（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 多依果酒釀造工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of Docynia delavayi fruit wine

1.3.4 測(cè)定方法

（1）理化指標(biāo)

酒精度：參考GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》中酒精計(jì)法測(cè)定；總糖、總酸含量：分別參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定、酸堿滴定法測(cè)定；可溶性固形物含量：參考GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中折光計(jì)法測(cè)定。

（2）微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)：參考GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定；大腸菌群計(jì)數(shù)：參照GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》測(cè)定。

（3）感官評(píng)價(jià)

根據(jù)多依果果酒的特點(diǎn)，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中感官檢查與評(píng)定方法和標(biāo)準(zhǔn)，制定多依果感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，并組建感官評(píng)定小組20人進(jìn)行感官評(píng)分，取其平均值為評(píng)分結(jié)果。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 多依果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of Docynia delavayi fruit wine

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 10進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，采用Origin 2008進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 多依果酒釀造工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 白砂糖添加量對(duì)多依果酒發(fā)酵的影響

白砂糖添加量對(duì)多依果酒發(fā)酵的影響見圖1。由圖1可知，白砂糖添加量在20%～28%的范圍內(nèi)，隨著白砂糖添加量的逐漸增加，多依果酒的酒精度和感官評(píng)分均呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢(shì)，可溶性固形物含量則呈現(xiàn)先持平后升高的趨勢(shì)。當(dāng)白砂糖添加量＜24%之前，白砂糖添加量過低，發(fā)酵不充分，導(dǎo)致果酒的酒精度偏低，且口感發(fā)澀，感官評(píng)分偏低；當(dāng)白砂糖添加量為24%時(shí)，果酒的酒精度達(dá)到最高（7.30%vol），此時(shí)酒液感官評(píng)分也是最佳（96分）；而當(dāng)白砂糖添加量＞24%之后，可溶性固形物含量急劇上升，殘?zhí)橇窟^多，反而不利于酵母菌的繁殖，導(dǎo)致果酒的酒精度下降，而且過甜的口感也使得感官評(píng)分不高。因此，確定最佳的白砂糖添加量為24%。

2.1.2 二氧化硫添加量對(duì)多依果酒發(fā)酵的影響

二氧化硫在果酒發(fā)酵過程中起到殺菌、保鮮、提高其口感質(zhì)量的作用。二氧化硫添加量對(duì)多依果酒發(fā)酵的影響見圖2。

圖2 二氧化硫添加量對(duì)多依果酒發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of SO2 addition on Docynia delavayi fruit wine fermentation

由圖2可知，二氧化硫添加量在4%～8%的范圍內(nèi)，對(duì)多依果酒的酒精度影響較小，酒精度、感官評(píng)分及可溶性固形物含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)二氧化硫添加量為5%時(shí)，酒精度達(dá)到最大（8.32%vol），此時(shí)果酒感官評(píng)分也最高（97分）；當(dāng)二氧化硫添加量＞5%之后，二氧化硫含量過高，酵母菌的活性受到抑制，可溶性固形物含量增加，感官評(píng)分降低。因此，確定最佳二氧化硫添加量為5%。

2.1.3 酵母菌接種量對(duì)多依果酒發(fā)酵的影響

酵母菌接種量對(duì)多依果酒發(fā)酵的影響見圖3。由圖3可知，酵母菌接種量在1%～5%范圍內(nèi)，隨著酵母菌接種量的逐漸增加，多依果酒的酒精度呈現(xiàn)先增高后平緩的趨勢(shì)，感官評(píng)分呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可溶性固形物含量呈現(xiàn)先快速下降后平緩的趨勢(shì)。當(dāng)酵母菌的接種量＜3%之前，其接種量與果酒的酒精度呈正相關(guān)。當(dāng)酵母菌接種量為3%時(shí)，酒精度最高達(dá)到9.48%vol。但當(dāng)酵母菌接種量＞3%之后，其本身需要消耗果肉的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致酒精轉(zhuǎn)化率下降[21]。而且酵母菌的接種量在一定程度上影響了果酒的果香味，使得感官評(píng)分一直下降。因此，綜合評(píng)價(jià)酵母菌的最佳接種量為3%。

圖3 酵母菌接種量對(duì)多依果酒發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on Docynia delavayi fruit wine fermentation

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多依果酒發(fā)酵的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)多依果酒發(fā)酵的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多依果酒發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of fermentation time on Docynia delavayi fruit wine fermentation

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間（5～9 d）的延長(zhǎng)，酒精度和可溶性固形物含量整體趨于平緩，感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為6 d時(shí)，酒精度達(dá)到最大（8.48%vol），此時(shí)酒液感官評(píng)分也最高（98分）。發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，果香味變淡，感官評(píng)分逐漸下降。因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為6 d。

2.2 多依果酒釀造工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 回歸模型的建立與方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定室溫（18～26 ℃）發(fā)酵6 d，選用酒精度（Y）為響應(yīng)值，以白砂糖添加量（A）、二氧化硫添加量（B）、酵母菌接種量（C）為考察因素，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 多依果酒釀造工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation technology optimization of Docynia delavayi fruit wine

利用Design Expert 10軟件對(duì)表3的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到二次多元回歸方程：

Y=9.260-0.220A+0.100B+0.365C+0.180AB-0.010AC-0.110BC-0.635A2+0.045B2+0.015C2

由表4可知，該模型的P值＜0.000 1，極顯著，說明所得方程有意義；失擬項(xiàng)P值＞0.05，不顯著，說明所構(gòu)建的模型很好，與試驗(yàn)的差異較小；相關(guān)系數(shù)R2為0.950 4，調(diào)整系數(shù)R2adj為0.956 2，差值＜0.2，說明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值有較好的相關(guān)性，試驗(yàn)誤差較小；模型的信噪比為21.788，遠(yuǎn)大于4，則表明該模型適合用于多依果酒釀造工藝和酒精度的預(yù)測(cè)。在該模型中，一次項(xiàng)A、C、交叉項(xiàng)AB和二次項(xiàng)A2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值大小可知，各因素對(duì)多依果酒酒精度影響的主次順序?yàn)椋航湍妇臃N量（C）＞白砂糖添加量（A）＞二氧化硫添加量（B）。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析

對(duì)多依果酒的酒精度產(chǎn)生影響的各因素兩兩交互作用的響應(yīng)面及等高線見圖5。由圖5a可知，響應(yīng)曲面傾斜度很高，等高線呈橢圓形，說明白砂糖添加量和二氧化硫添加量的交互作用對(duì)多依果酒的酒精度有極其顯著性影響。由圖5b可知，響應(yīng)曲面有傾斜度，等高線趨于圓形，說明白砂糖添加量和酵母菌添加量的交互作用對(duì)酒精度的影響較小。由圖5c可知，響應(yīng)曲面傾斜度不高，等高線接近橢圓形，說明二氧化硫添加量和酵母菌添加量的交互作用對(duì)酒精度有影響，但沒有達(dá)到顯著性水平（P＞0.05）。

結(jié)合以上結(jié)果分析，根據(jù)回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得到多依果酒的最優(yōu)釀造條件為：白砂糖添加量23.69%，二氧化硫添加量4.51%，酵母菌接種量3.97%，在此工藝條件下，室溫（18～26 ℃）發(fā)酵6 d，多依果酒的酒精度理論值為9.74%vol。根據(jù)實(shí)際情況，將工藝參數(shù)修正為：白砂糖添加量23.7%，二氧化硫添加量4.5%，酵母菌接種量4.0%，按修正后的工藝參數(shù)值進(jìn)行模型的驗(yàn)證試驗(yàn)，得到多依果果酒的實(shí)際酒精度為9.82%vol，與理論值接近，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化多依果酒釀造工藝條件是準(zhǔn)確可行的，該模型有一定的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 各因素交互作用對(duì)多依果酒酒精度影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on alcohol content in Docynia delavayi fruit wine

2.3 多依果酒的質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

對(duì)按最優(yōu)工藝參數(shù)制備的多依果酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和部分質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定。感官評(píng)定結(jié)果表明，多依果酒體具有多依果特征香氣，與酒香混為一體，色澤為黃橙色，口感醇和，感官評(píng)分為98分。質(zhì)量指標(biāo)結(jié)果表明，酒精度9.82%vol，可溶性固形物含量13.00%，總酸含量7.20 g/L，菌落總數(shù)18CFU/mL，大腸菌群＜3MPN/100mL。果酒各指標(biāo)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均符合NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》的標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)論

以云南省普洱市特產(chǎn)的多依果為原料，酒精度、感官評(píng)分、可溶性固形物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)和優(yōu)化試驗(yàn)，確定多依果酒的最佳釀造工藝：白砂糖添加量23.7%，二氧化硫添加量4.5%，酵母菌接種量4.0%，室溫（18～26 ℃）發(fā)酵6 d。在此最優(yōu)釀造工藝條件下，多依果酒顏色呈黃橙色，果香與酒香協(xié)調(diào)，滋味醇厚，感官評(píng)分為98分。酒精度為9.82%vol，可溶性固形物含量為13.00%，總酸含量7.20 g/L，菌落總數(shù)18 CFU/mL，大腸菌群＜3 MPN/100 mL，各項(xiàng)指標(biāo)均符合相關(guān)果酒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。