高玉榮，李大鵬，宋俊梅

（巢湖學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽合肥 238000）

隨著人們生活水平的提高，開發(fā)富含益生菌、益生元等具有改善人體健康功能的活性物質(zhì)的保健食品已經(jīng)成為食品工業(yè)的重要發(fā)展方向之一[1]。研究證明，益生菌能競爭性抑制腸道致病菌的生長，從而具有維持腸道菌群平衡的功能[2]。此外，某些益生菌還具有抗氧化、同化膽固醇及提高免疫力等特殊保健功能[3]。因此，益生菌尤其是雙歧桿菌（Bifidobacterium）和乳桿菌屬（Lactobacillus）的益生菌已經(jīng)被越來越多地應(yīng)用于食品工業(yè)。

目前的消費市場，飲料不僅要具有解渴的功能，消費者更多地追求其補充能量、抗氧化、延緩衰老等特殊功能[4]。果蔬飲料中富含碳水化合物、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，不僅有利于人體健康，也有利于益生菌的生長[5]。甘藍、蘋果、馬鈴薯等果蔬已經(jīng)用作益生菌飲料生產(chǎn)的原料[6-7]。研究表明，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等乳酸菌可以耐受果蔬本身和乳酸菌發(fā)酵導(dǎo)致的較高的酸度和較低的pH環(huán)境[8-9]。劉磊等[10]以保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）為發(fā)酵菌株，進行了渾濁型龍眼果肉乳酸菌發(fā)酵飲料加工工藝的優(yōu)化。李維妮等[11]對益生菌發(fā)酵蘋果汁的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化并對發(fā)酵前后的有機酸的變化進行了分析。鄭欣等[12]以荔枝汁為原料，進行乳酸菌發(fā)酵果汁的制備營養(yǎng)品質(zhì)的變化及貯藏穩(wěn)定性研究。另外，采用蘋果山藥復(fù)合果蔬汁、枸杞胡蘿卜復(fù)合汁、黃秋葵、桑葚汁等[13-14]為原料進行了乳酸菌發(fā)酵飲料的工藝研究。這些研究表明以果蔬汁單獨或復(fù)合進行益生菌發(fā)酵飲料的制備是可行的，為益生菌發(fā)酵果蔬制品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

我國葡萄種植面積大，資源豐富。葡萄中不僅含碳水化合物、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，而且含有抗氧化、提高免疫力、抗癌和減少心腦血管疾病風(fēng)險的多酚、花青素、膳食纖維等功能性成分[15]。目前葡萄主要以鮮食為主，深加工產(chǎn)品主要有葡萄干、葡萄汁和葡萄酒。王舸楠等[16]采用響應(yīng)面法方法對復(fù)合菌種發(fā)酵葡萄玫瑰花飲品的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。但是以葡萄為原料制備富含益生菌的功能性飲料的研究鮮見報道。為了更好地開發(fā)功能型葡萄汁飲料，本研究以前期篩選的具有體外降膽固醇降甘油三酯功能的益生菌嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）為菌種，采用單因素試驗和正交試驗，對影響益生菌生長和代謝的初始pH、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等發(fā)酵工藝進行了研究和優(yōu)化，為益生菌發(fā)酵葡萄汁飲料的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

巨峰葡萄：購于安徽巢湖市，8月初采摘，新鮮，無損傷、病害或腐爛；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）L2-16：從發(fā)酵黃瓜中分離的具有體外降膽固醇和甘油三酯功能的益生菌，美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）接收號KU922757[17]，巢湖學(xué)院食品工程實驗室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

果膠酶（50 000 U/g）：河南華悅化工產(chǎn)品有限公司；碳酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JYZ-V5 PLUS九陽智能原汁機：九陽股份有限公司；DHG-9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；LDZM-80KCS-Ⅲ立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及制備

將-20 ℃保藏的嗜酸乳桿菌L2-16甘油管，接種到裝液量為50 mL/150 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，用無菌水離心洗滌3次，并用無菌水調(diào)至適宜濃度，得到嗜酸乳桿菌菌懸液，備用。

1.3.2 發(fā)酵葡萄汁飲料制備

將葡萄除梗后，清洗，用榨汁機壓榨，制成新鮮果汁，加果膠酶（果膠酶的添加量0.1 g/kg）于15 ℃條件下酶解10 h，取上清液，采用1 mol/L的碳酸鈉調(diào)節(jié)pH，接種制備的嗜酸乳桿菌菌懸液（接種量0.5%～3.0%），在40 ℃靜置發(fā)酵至pH不再增加。

1.3.3 益生菌發(fā)酵葡萄汁飲料工藝優(yōu)化單因素試驗

將葡萄汁（初始pH 3.3）用1 mol/L的碳酸鈉或鹽酸將初始pH值分別調(diào)節(jié)至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，分別按照0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的接種量接入嗜酸乳桿菌L2-16菌懸液，在20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃發(fā)酵12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h，測定嗜酸乳桿菌活菌數(shù)并進行感官評價。

1.3.4 益生菌發(fā)酵葡萄汁飲料工藝優(yōu)化正交試驗

以葡萄汁發(fā)酵的初始pH、接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間為影響因素，設(shè)計4因素3水平的正交試驗，以嗜酸乳桿菌活菌數(shù)和感官評價結(jié)果為評價指標(biāo)，確定最佳的發(fā)酵工藝條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation technology optimization

1.3.5 分析檢測

（1）嗜酸乳桿菌活菌數(shù)

采用平板計數(shù)法測定嗜酸乳桿菌活菌數(shù)[18]。計數(shù)平板表面菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即為嗜酸乳桿菌活菌數(shù)。

（2）益生菌發(fā)酵葡萄汁飲料酸度

采用pH計法，按照GB 5009.239—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定》中規(guī)定的方法測定發(fā)酵葡萄汁飲料的酸度[19]。

（3）益生菌發(fā)酵葡萄汁可溶性固形物含量

按照GB T12143—2008《飲料通用分析方法》中規(guī)定的方法測定發(fā)酵葡萄汁飲料的可溶性固形物含量[20]。

（4）感官評定

參考王舸楠等[16]對葡萄玫瑰花飲品感官評價方法，并根據(jù)益生菌發(fā)酵葡萄汁飲料的特點進行修改。制備的發(fā)酵葡萄汁由10名經(jīng)訓(xùn)練的專業(yè)教師和學(xué)生從色澤、香氣、風(fēng)味和體態(tài)四方面進行感官評價，滿分100分，具體評分細則見表2。

表2 發(fā)酵葡萄汁感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of fermented grape juice

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌發(fā)酵葡萄汁飲料的單因素試驗

2.1.1 初始pH對葡萄汁發(fā)酵的影響

圖1 初始pH值對葡萄汁發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of initial pH on grape juice fermentation

由圖1可以看出，當(dāng)初始pH為3.5時，由于酸度過大，對嗜酸乳桿菌的生長產(chǎn)生不利的影響，導(dǎo)致其生長速度減慢，發(fā)酵后活菌數(shù)較低；在初始pH3.5～5.0，隨著初始pH的增大，嗜酸乳桿菌的活細胞數(shù)逐漸增大，當(dāng)初始pH＞5.0時，活菌數(shù)呈下降的趨勢。在初始pH3.5～4.5，隨著初始pH的增大，發(fā)酵葡萄汁的感官評分逐漸提高，當(dāng)初始pH＞4.5時，感官評分呈下降的趨勢。因此，綜合考慮確定適宜的初始pH值為4.5。

2.1.2 接種量對葡萄汁發(fā)酵的影響

圖2 接種量對葡萄汁發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of inoculum on grape juice fermentation

由圖2可以看出，當(dāng)接種量為0.5%～2.0%時，隨著接種量的增大，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)提高，但隨著接種量的繼續(xù)增大，活菌數(shù)不再增加。接種量為0.5%～2.0%時，感官評分隨著接種量的增大有增加的趨勢，但接種量繼續(xù)增大，感官評分不再提高反而下降。因此，綜合考慮，確定適宜的接種量為2.0%。

2.1.3 發(fā)酵溫度對葡萄汁發(fā)酵的影響

由圖3可以看出，發(fā)酵溫度在20～36 ℃，隨著溫度的升高，活細胞數(shù)逐漸增加，但當(dāng)溫度繼續(xù)提高，活細胞數(shù)顯著下降。在20～32 ℃時，隨著發(fā)酵溫度的提高，發(fā)酵葡萄汁的感官評分逐漸增加，當(dāng)溫度提高至36 ℃時，感官評分沒有明顯下降，當(dāng)發(fā)酵溫度提高至40 ℃時，感官評分下降。因此，綜合考慮活細胞數(shù)和感官品質(zhì)情況，選擇較適宜的發(fā)酵溫度為32 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對葡萄汁發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on grape juice fermentation

2.1.4 發(fā)酵時間對葡萄汁發(fā)酵的影響

圖4 發(fā)酵時間對葡萄汁發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of fermentation time on grape juice fermentation

由圖4可以看出，發(fā)酵時間在12～20 h范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)增大，此后，隨著發(fā)酵時間的延長，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)不再顯著增加，甚至有下降的趨勢。發(fā)酵時間在20 h后嗜酸乳桿菌細胞進入到生長的穩(wěn)定期，死亡率大于繁殖速率。發(fā)酵時間在12～24 h范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，感官評分逐漸提高，此后，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵葡萄汁的感官評分呈下降的趨勢。因此，綜合考慮，確定適宜的發(fā)酵時間為24 h。

2.2 益生菌發(fā)酵葡萄汁的正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計4因素3水平的正交試驗，正交試驗結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

由表3可知，以活細胞數(shù)作為評價指標(biāo)，對活細胞數(shù)影響的主次順序為發(fā)酵時間＞初始pH＞發(fā)酵溫度＞接種量，最佳發(fā)酵工藝條件組合為A2B3C2D2，即最佳初始pH 4.5，接種量2.5%，發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵時間24 h。以感官評分作為評價指標(biāo)，對感官評分影響的主次順序為初始pH＞接種量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度，最佳發(fā)酵工藝條件組合為A2B3C2D3，即最佳初始pH 4.5，接種量2.5%，發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵時間28 h。綜合考慮活細胞數(shù)和感官品質(zhì)，確定最佳發(fā)酵工藝條件為初始pH 4.5，接種量2.5%，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵時間26 h。在此最佳工藝條件下，進行3次平行驗證試驗，活細胞數(shù)對數(shù)平均值為8.87，感官評分平均值為88.3分。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation technology optimization

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

3 結(jié)論

利用益生菌嗜酸乳桿菌L2-16菌株發(fā)酵巨峰葡萄汁，通過正交試驗確定葡萄汁發(fā)酵飲料的最佳工藝條件為最佳初始pH 4.5，接種量2.5%，發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵時間26 h。在此優(yōu)化條件下，葡萄汁發(fā)酵飲料活菌數(shù)對數(shù)值為8.87，感官評分88.3分，酸度為90.1°T，可溶性固形物含量17.2%。

功能益生菌的葡萄汁發(fā)酵飲料的研制，不僅賦予了產(chǎn)品的功能性，延長了葡萄產(chǎn)業(yè)鏈，還可增加葡萄的附加值，有利于葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，具有較好的市場推廣前景。