張 強，趙翠梅，李曉偉，趙靖華，王曉彬，郭曉萱，閆裕峰，王 敏，鄭 宇

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457；2.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030400）

食醋在我國有3 000多年的悠久歷史，是古代科學(xué)文化技術(shù)傳承的重要組成[1-2]。我國傳統(tǒng)食醋的釀造大多采用固態(tài)發(fā)酵工藝，食醋的發(fā)酵過程大致可以分為酒精發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段[3]。在酒精發(fā)酵階段由含糖或淀粉的原料，通過微生物的作用產(chǎn)生乙醇；在醋酸發(fā)酵階段，眾多微生物共同作用，其中醋酸菌將乙醇氧化為乙酸，乳酸菌將還原糖代謝產(chǎn)生乳酸，從而形成食醋的主體風(fēng)味[4]。有機酸是食醋酸味的主要來源，對食醋的風(fēng)味品質(zhì)起到至關(guān)重要作用。

食醋中的有機酸可分為揮發(fā)性酸和不揮發(fā)酸。揮發(fā)酸以乙酸為主，約占有機酸總量的80%，構(gòu)成食醋香氣的中心。不揮發(fā)酸以乳酸為主，約占有機酸總量的20%。純的乙酸具有刺激性的臭味，由于乳酸等不揮發(fā)酸的存在，使食醋酸味綿長、柔和可口[5]。有機酸不僅具有很強的殺菌和抑菌能力，還可以防止食物中維生素C（vitamin C，VC）的破壞[6]。有機酸等風(fēng)味物質(zhì)的生成與其中微生物的代謝作用密切相關(guān)，微生物通過直接或間接（產(chǎn)生相關(guān)酶系）的代謝方式，將原料中的營養(yǎng)物質(zhì)不斷轉(zhuǎn)化成風(fēng)味物質(zhì)[7]。食醋發(fā)酵過程中主要包括醋酸菌、乳酸菌、芽孢菌等細菌以及霉菌、酵母菌等真菌。其中醋酸菌和乳酸菌分別是醋酸和乳酸的最主要生產(chǎn)者，兩者合占總微生物的90%以上，是醋酸發(fā)酵階段最重要的微生物[7]。醋酸菌能夠通過乙醇脫氫酶的作用將乙醇迅速氧化成乙酸，乳酸菌則通過乳酸脫氫酶等的作用將還原糖等代謝生成乳酸以及其他多種有機酸。

溫度和溶氧對食醋釀造過程產(chǎn)酸有重要影響，翻醅是傳統(tǒng)固態(tài)食醋醋酸發(fā)酵階段的一個重要工藝[8-11]，通過翻醅補充氧氣和進行物質(zhì)交換，改變溫度、溶氧等微生物生長代謝的主要環(huán)境。本研究對食醋固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵過程中溫度和翻醅頻次影響有機酸的產(chǎn)生規(guī)律進行研究，分析不同溫度（25～45 ℃）和不同翻醅頻次（12～48 h/次）條件下有機酸的生產(chǎn)情況，并進一步分析了溫度和翻醅條件對醋酸菌和乳酸菌關(guān)鍵產(chǎn)酸基因表達的影響。由于傳統(tǒng)食醋的醋酸發(fā)酵過程中醋酸菌和乳酸菌占總微生物的95%以上，Acetobacter pasteurianus占醋酸菌的95%以上，Lactobacillus helveticus占乳酸菌的65%以上[4，12]。本研究以這兩株微生物作為產(chǎn)酸表達的研究對象，從分子和代謝水平闡釋溫度和翻醅對食醋發(fā)酵過程中有機酸生成的影響，為食醋行業(yè)技術(shù)進步奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）CP-A11、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）：篩選自食醋發(fā)酵過程，本實驗室保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

RNA plus試劑盒、Revert Aid TM第一鏈DNA合成試劑盒：大連寶生物有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%，無水乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，檸檬酸銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.058%，硫酸錳0.025%，調(diào)節(jié)pH為6.2～6.8。121 ℃滅菌20 min。

葡萄糖酵母浸膏（glucose yeast，GY）培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏2%，乙醇3.5%（V/V）。121 ℃滅菌20 min。

1.1.4 引物

根據(jù)醋酸菌乙醇脫氫酶和乳酸菌乳酸脫氫酶的特異性基因片段，設(shè)計特異性引物用于反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）分析，如表1所示。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2 儀器與設(shè)備

GHP-9270恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；5418型小型高速離心機、Mastercycler?nexus X2 PCR基因擴增儀：德國Eppendorf公司；DZKW-C電熱恒溫水浴鍋：河北黃華市航空儀器廠；StepOnePlusTMABI Step-One Plus Real Time PCR System：美國Applied Biosystems公司；SBA-40C生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 取樣

根據(jù)山西老陳醋發(fā)酵工藝，采集醋酸發(fā)酵階段樣品，采用五點取樣法分別采集傳統(tǒng)醋酸發(fā)酵1 d、3 d、5 d、7 d、9 d的樣品分別代表醋酸發(fā)酵的前期、中前期、中期、中后期和后期。采樣位置距離醋醅表面30 cm，相同發(fā)酵時期的醅樣平行采集三份，每份約100 g，裝入無菌取樣袋，置于冰盒中運回實驗室，保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.2 固態(tài)食醋發(fā)酵

在實驗室條件下模擬固態(tài)釀造工藝。將原材料高粱等粉碎為四到六瓣后，加入溫水蒸煮1.5～2.0 h，然后按高粱∶大曲粉=1∶0.625的比例拌曲?；旌暇鶆蚝?，置于酒精發(fā)酵缸（約1.5 m深）中進行為期12 d的酒精發(fā)酵。取發(fā)酵結(jié)束酒醪，按照酒醪∶麩皮∶稻殼=5.0∶1.1∶0.6的比例混合均勻制成醋醅[13]，裝入5 L的發(fā)酵容器中，以發(fā)酵第3天的醋醅為火醅接種進行醋酸發(fā)酵。

1.3.3 食醋固態(tài)發(fā)酵過程理化指標分析

對食醋固態(tài)發(fā)酵過程主要理化指標進行分析，溫度變化使用溫度計在取樣前測定。將溫度計插入醋醅以下約30 cm處，待溫度計的示數(shù)穩(wěn)定后讀數(shù)；溶氧含量使用MG01便攜式氣體檢測儀在取樣前測定。將氣體收集管插入醋醅以下約30 cm處，打開開關(guān)進行測量，記錄儀器讀數(shù)；生物量測定采用細胞干質(zhì)量法[14]。

總酸、不揮發(fā)酸、還原糖、氨基酸態(tài)氮和有機酸等指標參照NIE Z等[15]的方法進行測定，乙醇含量采用生物傳感分析儀進行測定；醋醅樣品中總糖的檢測采用山西老陳醋國家標準GB/T 19777—2013《地理標志產(chǎn)品山西老陳醋》中斐林試劑法[16]。

1.3.4 發(fā)酵條件對醋酸菌和乳酸菌基因轉(zhuǎn)錄水平分析

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative-polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）的方法進行醋酸菌代謝醋酸和乳酸菌代謝乳酸的關(guān)鍵酶（乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶）基因的轉(zhuǎn)錄分析。將醋酸菌和乳酸菌分別在GY和MRS培養(yǎng)基中活化后接入滅菌后的醋醅中，然后分別在不同溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）、翻醅（12 h、24 h、36 h、48 h）條件下培養(yǎng)至醋酸發(fā)酵中期，收集菌懸液?？俁NA采用RNA plus試劑盒進行分離。用DNase I處理去除殘留的DNA。采用Takara cDNA合成試劑盒，將核糖核酸（ribonucleic acid，RNA反轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），然后進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR），結(jié)果分析采用2-△△Ct法。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)食醋醋酸發(fā)酵過程分析

2.1.1 食醋醋酸發(fā)酵階段理化指標變化

山西老陳醋是我國著名傳統(tǒng)食醋，采用固態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)。醋酸發(fā)酵階段是食醋產(chǎn)酸的主要階段，也是食醋中其他風(fēng)味物質(zhì)形成的重要階段。總酸和乙醇是食醋醋酸發(fā)酵階段的重要指標。測定食醋醋酸發(fā)酵階段總酸、不揮發(fā)酸、乙醇、氨基酸態(tài)氮和還原糖含量的變化情況，結(jié)果見圖1。

圖1 山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程曲線Fig.1 Curves of acetic acid fermentation process of Shanxi aged vinegar

由圖1可知，醋酸發(fā)酵過程中乙醇和總酸分別呈現(xiàn)下降和上升的趨勢，乙醇的消耗和總酸生成的平均速率分別為0.515 g/（100 g·d）和0.373 g/（100 g·d）。不揮發(fā)酸含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，從發(fā)酵前期的1.62 g/100 g上升至發(fā)酵中期的1.83 g/100 g，隨后下降至1.39 g/100 g。不揮發(fā)酸的降低與醋酸發(fā)酵中后期乳酸菌相對豐度降低，醋酸菌大量繁殖積累，乳酸和其他不揮發(fā)酸被醋酸菌等微生物分解代謝有關(guān)[17]。還原糖含量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，還原糖含量在發(fā)酵中前期最低（0.72 g/100 g），隨后逐漸升高至發(fā)酵后期的2.48 g/100 g。在醋酸發(fā)酵過程中，還原糖主要來源于大分子多糖的分解，用于微生物的生長代謝，其中乳酸菌是醋酸發(fā)酵階段濃度最高的微生物，他們主要利用還原糖生長和代謝，醋酸發(fā)酵過程還原糖的變化趨勢與乳酸菌的相對豐度變化趨勢一致[15]。氨基態(tài)氮含量呈現(xiàn)略微升高的趨勢，從發(fā)酵前期的0.06 g/100 g緩慢升高至發(fā)酵后期的0.16 g/100 g，其含量與醋醅中的高分子蛋白質(zhì)或多肽的不斷分解有關(guān)。不揮發(fā)酸和氨基態(tài)氮等物質(zhì)能為醋醅提供良好的緩沖體系，使pH值均處于3.8～4.1之間，在該pH范圍內(nèi)適合醋酸菌、乳酸菌生長代謝，同時能夠抑制體系中雜菌的生長[18]。

2.1.2 食醋醋酸發(fā)酵階段有機酸含量變化

有機酸是食醋酸味物質(zhì)的主要來源，也是構(gòu)成食醋風(fēng)味特征的最主要成分，豐富的有機酸能夠賦予食醋獨特的風(fēng)味與口感。乙酸和乳酸是食醋中最主要的有機酸，占有機酸總量的90%以上，且兩者的比例對食醋的風(fēng)味有重要影響[18]。還原糖、乙醇分別與乳酸和乙酸的生成密切相關(guān)，因此進一步分析了發(fā)酵過程有機酸的變化。山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程中有機酸含量的變化情況，結(jié)果見圖2。

圖2 山西老陳醋發(fā)酵過程中有機酸含量的變化Fig.2 Changes of organic acids contents during Shanxi aged vinegar fermentation

由圖2可知，乙酸含量在整個發(fā)酵過程中呈上升趨勢，其生成速率先升高后略微降低。乳酸含量呈先升高后降低趨勢，可能由于發(fā)酵中后期乳酸菌的相對豐度下降，并且乳酸作為中間代謝產(chǎn)物或碳源被其他微生物代謝[2]。醋酸發(fā)酵前期，乳酸的合成速率高于分解速率，乳酸含量不斷升高，而隨著酸度和溫度等外界條件的變化，微生物群落逐步演替，使得發(fā)酵中期、中后期和后期乳酸的合成速率小于分解速率，進而使乳酸含量逐步降低。隨著乙酸含量的快速升高，乳酸/乙酸在整個發(fā)酵過程中呈現(xiàn)逐步下降的趨勢（圖2A）。其他有機酸主要包括檸檬酸、草酸、丙酮酸、酒石酸和蘋果酸（圖2B），其中，檸檬酸的含量相對較高，在整個發(fā)酵過程中呈明顯增長趨勢。這些有機酸雖然含量相對較低，但能夠增加食醋口感的豐富度，并且和乳酸等形成的緩沖體系，可緩解乙酸的刺激性，使食醋酸而不澀，醇厚綿長[19]。

2.1.3 食醋醋酸發(fā)酵階段有機酸與理化性質(zhì)的關(guān)系

發(fā)酵過程中有機酸相對含量及其與發(fā)酵過程主要理化性質(zhì)之間的關(guān)系見圖3。

由圖3可知，乳酸和乙酸兩種有機酸始終合占總有機酸的95%以上，其中乳酸所占百分比含量呈快速下降趨勢，乙酸所占百分比呈快速上升的趨勢。由圖3A可知，除乳酸和乙酸外，其他有機酸合占總有機酸5%左右。由圖3B可知，乳酸和發(fā)酵中前期（3 d）和中期（5 d）樣品相關(guān)性最大，乙酸和發(fā)酵中后期（7 d）和后期（9 d）樣品相關(guān)性最大，說明乳酸和乙酸主要在這些時期積累。與發(fā)酵中前期和中期樣品相關(guān)性最大的理化指標是溫度，而溶氧含量則與發(fā)酵中后期和后期的樣品有最大的負相關(guān)性，說明發(fā)酵過程中溫度和氧氣含量對乙酸和乳酸的生成有很大的影響。

圖3 山西老陳醋發(fā)酵過程中有機酸含量與理化性質(zhì)的關(guān)系分析Fig.3 Correlation between organic acids and physicochemical properties during Shanxi aged vinegar fermentation

2.2 溫度和翻醅對食醋固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

溫度和溶氧是反映發(fā)酵狀態(tài)的重要指標，山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程中溫度和溶氧含量變化見圖4。由圖4可知，發(fā)酵過程中溫度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，溫度在發(fā)酵中期最高，達到47 ℃。醋醅的熱量主要源自發(fā)酵過程中微生物的代謝，在發(fā)酵的中前期、中期和中后期始終維持在43 ℃以上，說明這一時期微生物代謝更為活躍，溶氧含量則呈現(xiàn)與溫度相反的趨勢。

圖4 山西老陳醋發(fā)酵過程中溫度和溶氧量變化Fig.4 Changes of temperature and dissolved oxygen contents during Shanxi aged vinegar fermentation

2.2.1 溫度和翻醅對食醋固態(tài)發(fā)酵總酸含量的影響

總酸是反映食醋發(fā)酵狀態(tài)的重要指標，反映了發(fā)酵過程微生物整體代謝活性、原料利用率和發(fā)酵效率等情況[15]。分析不同溫度（25～45 ℃）和不同翻醅頻次（12～48 h/次）條件下總酸的生產(chǎn)情況，結(jié)果見圖5。由圖5可知，醋酸發(fā)酵過程，生物量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，主要原因在于隨著發(fā)酵時間延長，醋醅中酸度增加，同時乙醇、糖類等應(yīng)用物質(zhì)濃度降低，使微生物豐度下降、產(chǎn)酸速率下降[15]。由圖5A和5B可知，30 ℃和35 ℃條件下微生物的生長和產(chǎn)酸速率均最大，說明在該溫度條件下微生物的代謝活性最高。醋酸菌和乳酸菌的最適生長溫度分別為30 ℃和37 ℃左右，因此該溫度范圍最有利于乙酸和乳酸菌的生長和代謝[20]。由圖5C和5D可知，隨著翻醅頻次的增加，微生物生長和產(chǎn)酸速率增加。其原因在于，固態(tài)發(fā)酵體系水分活度低，營養(yǎng)物質(zhì)交換不充分，翻醅有利于增加氧氣濃度及營養(yǎng)物質(zhì)的擴散，從而促進了微生物的生長和代謝。

圖5 溫度和翻醅對微生物生長和產(chǎn)酸的影響Fig.5 Effect of temperature and Cupei-turning on growth and acid production of microorganisms

2.2.2 溫度和翻醅對乙酸生成的影響

醋酸發(fā)酵過程中乙酸主要通過醋酸菌氧化乙醇生成。山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程醋醅溫度逐漸增加，發(fā)酵中期溫度一般維持在40 ℃以上，甚至達到45 ℃[13]分析不同溫度（25～45 ℃）和不同翻醅頻次（12～48 h/次）條件下乙酸的生產(chǎn)情況，結(jié)果見圖6。由圖6A和圖6B可知，乙酸在30 ℃條件下生成速率最高，45 ℃條件下合成速率最慢，對應(yīng)的乙醇消耗分別在30 ℃和45 ℃有最大和最小消耗速率。由圖6C和6D可知，隨著翻醅頻次的增加，乙酸合成速率迅速增加，相應(yīng)的乙醇消耗速率也更快。溫度和翻醅頻次（對應(yīng)不同濃度氧含量）對食醋固態(tài)發(fā)酵過程中乙酸的生成都有重要的影響，相比來說，翻醅頻次對乙酸的生成影響更大。其原因在于，醋酸菌為好氧微生物，在充足氧氣的條件下才能更快速將乙醇氧化成乙酸。

圖6 溫度和翻醅對乙酸生成的影響Fig.6 Effect of temperature and Cupei-turning on acetic acid production

2.2.3 溫度和翻醅對乳酸生成的影響

乳酸作為食醋中最主要不揮發(fā)酸對食醋的品質(zhì)有至關(guān)重要的影響[17]。分析不同溫度（25～45 ℃）和不同翻醅頻次（12～48 h/次）條件下乳酸的生產(chǎn)情況，結(jié)果見圖7。由圖7可知，固態(tài)食醋醋酸發(fā)酵階段乳酸含量呈略微升高后迅速下降的趨勢，乳酸含量的下降可能與乳酸菌相對豐度的下降和醋酸菌等微生物的代謝消耗有關(guān)。乳酸合成速率分別在40 ℃時最大[0.293 g/（100 g·d）]，25 ℃時最小[0.169 g/（100 g·d）]。發(fā)酵過程中總糖含量下降速率與乳酸含量平均增長速率相似，表明發(fā)酵過程中乳酸菌等微生物主要通過代謝糖類等物質(zhì)生成乳酸。由圖7A和7B可知，在發(fā)酵中后期，乳酸濃度開始下降，其中30 ℃條件下乳酸下降速率最大，其原因為醋酸菌可以通過乳酸脫氫酶將乳酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，進而轉(zhuǎn)化成其他風(fēng)味物質(zhì)[21]，30 ℃下醋酸菌的代謝活性最強。因此，雖然30 ℃時醋酸的生成速率較大，但醋酸菌的高代謝活性導(dǎo)致了發(fā)酵結(jié)束乳酸濃度偏低。由圖7C和7D可知，隨著翻醅頻次的增加，發(fā)酵中前期乳酸含量逐漸降低。兩者相比較，溫度對乳酸的生成影響更大。

圖7 溫度和翻醅對乳酸生成的影響Fig.7 Effects of temperature and Cupei-turning on lactic acid production

2.3 溫度和翻醅對主要微生物關(guān)鍵產(chǎn)酸基因轉(zhuǎn)錄的影響

2.3.1 溫度和翻醅對巴氏醋桿菌乙酸合成代謝的影響。

分析不同溫度（25～45℃）和不同翻醅頻次（12～48h/次）條件下乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）基因轉(zhuǎn)錄水平和乙酸生成量見圖8。由圖8A可知，30 ℃條件下A.pasteurianus的ADH基因的轉(zhuǎn)錄水平最高，且隨著溫度的增加ADH基因轉(zhuǎn)錄水平降低。由圖8B可知，與ADH基因相對轉(zhuǎn)錄量對應(yīng)，30 ℃時乙酸平均生成速率最大，并且隨溫度增加而降低。翻醅與ADH基因的轉(zhuǎn)錄和乙酸生成呈正相關(guān)，隨著翻醅頻次的增加，ADH基因轉(zhuǎn)錄水平和乙酸生成速率逐漸增大。以上結(jié)果表明，翻醅頻次較溫度對醋酸菌的乙酸合成代謝影響更大。

圖8 溫度和翻醅對巴氏醋桿菌的乙酸合成代謝的影響Fig.8 Effect of temperature and Cupei-turning on acetic acid anabolism of Acetobacter pasteurianus

2.3.2 溫度和翻醅對瑞士乳桿菌乳酸合成代謝的影響

分析不同溫度（25～45℃）和不同翻醅頻次（12～48h/次）條件下乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）基因轉(zhuǎn)錄水平和乳酸生成量見圖9。由圖9A和圖9B可知，隨著溫度增加，瑞士乳桿菌LDH基因轉(zhuǎn)錄水平和乳酸的生產(chǎn)量逐漸增加，在40 ℃條件下均達到最大。由圖9C和9D可知，隨著翻醅頻率的增加，LDH基因轉(zhuǎn)錄水平和乳酸的生成逐漸降低。以上結(jié)果表明，溫度較翻醅頻次對乳酸菌的乳酸合成代謝影響更大。

圖9 溫度和翻醅對瑞士乳桿菌乳酸合成代謝的影響Fig.9 Effects of temperature and Cupei-turning on lactic acid anabolism of Lactobacillus helveticus

3 結(jié)論

乙酸和乳酸是山西老陳醋中最重要的有機酸，翻醅對其生產(chǎn)速率及兩者的比例有較大的影響。山西老陳醋翻醅工藝主要通過影響醋醅中溫度和氧氣濃度等發(fā)酵條件影響乳酸菌和醋酸菌的有機酸合成代謝。其中，翻醅有利于降低溫度，增加氧氣濃度，從而促進醋酸菌的生長和乙酸生成相關(guān)基因的表達，從而促進乙酸的生成。而乳酸菌則更適合在較高溫度下生長和代謝，翻醅操作過頻將限制乳酸菌的生長和乳酸脫氫酶的表達，進而影響乳酸的生成。