何曉磊，馬二秀，許世林，郭蓮娣，李佳川

（西南民族大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 610041）

會理石榴（Punica granatumL.）是四川攀西地區(qū)的道地特色農(nóng)產(chǎn)品，既是“無公害”的中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，又是中醫(yī)藥、藏醫(yī)藥中常用臨床藥物，具有良好的“藥食同源”之性[1]?，F(xiàn)代研究表明，石榴中不僅含有豐富的酚、酮及有機酸類化合物，還富含生物堿和各種人體所需的氨基酸[2-4]。

近年來，隨著社會經(jīng)濟發(fā)展和人民生活水平的提高，以天然藥食資源開發(fā)的保健果醋正成為市場新寵。保健果醋不僅在營養(yǎng)、風(fēng)味、口感上都比傳統(tǒng)食醋更佳，而且極大地保留了水果中富含的維生素、氨基酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，保健功效顯著，市場前景廣泛[5-7]。目前，以石榴為資源開發(fā)的保健果醋鮮有報道，國內(nèi)外研究主要集中在石榴汁飲料的開發(fā)與生產(chǎn)方面。CASSANO A等[8]運用兩步膜法建立了一種適用于濃縮石榴汁生產(chǎn)的集成膜工藝，所得濃縮果汁總可溶性固形物含量為520 g/kg，多酚及花色苷的含量分別為16.5%和11.7%，工藝較好的保留其抗氧化活性；劉志國等[9]研究報道石榴茶提取物能明顯提高小鼠的運動能力，增加心肌抗氧化指標(biāo)，顯示出較好的抗疲勞抗氧化作用。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上[10-15]，許世林等[16]創(chuàng)新提出將會理石榴與紅曲組合，通過液態(tài)發(fā)酵等方式制備出石榴紅曲保健果醋。

本研究擬在《保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法》[17]的指導(dǎo)下，對石榴紅曲保健果醋的主要營養(yǎng)成分進行分析；同時，分別建立小鼠高糖高脂模型、D-半乳糖氧化損傷小鼠模型，考察石榴紅曲果醋的降糖、降脂及體內(nèi)抗氧化活性，以期為石榴紅曲保健果醋相關(guān)活性物質(zhì)的質(zhì)量控制以及進一步產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

石榴紅曲保健果醋[16]：實驗室自制。

1.1.2 試劑

磺基水楊酸、蘆?。ň鶠榉治黾儯撼啥伎讫堅噭┯邢薰?；茚三酮溶液；17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)樣、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；福林-酚試劑：上海研域生物科技有限公司；小鼠胰島素（insulin，Ins）酶聯(lián)免疫分析試劑盒：美國RD公司；空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒及低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.3 實驗動物

美國癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠[無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，18～22 g，全雄，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2015-030]：四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

S-433D全自動氨基酸分析儀：德國Sykam公司；SN-3001酶標(biāo)儀：美國Thermo Formo公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；PHS-3C-3E數(shù)顯臺式酸度計：上海雷磁儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 石榴紅曲保健果醋營養(yǎng)成分分析

氨基酸含量：參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》[18]。

總黃酮含量：參考白立敏等[19-20]的測定方法。

總酚含量：參考吳佳[21]的測定方法。

還原糖含量：參照GB/T 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定》中的3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定[22]。

總酸含量：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法測定[23]。

可溶性固形物含量：采用手持糖度計測定[24]。

1.3.2 石榴紅曲保健果醋的功能學(xué)評價

（1）石榴紅曲保健果醋的降糖、降脂活性研究

參考趙興冉等[25-26]的方法，建立小鼠高糖、高脂復(fù)合模型。具體方法：取ICR小鼠，按體質(zhì)量隨機分為兩組，除10只為空白組外，其余均為模型組。模型組小鼠尾靜脈注射四氧嘧啶溶液60 mg/kg進行血糖造模（空白組注射等體積生理鹽水），造模72 h后，小鼠尾尖取血，測定小鼠空腹血糖（FBG），選取空腹血糖濃度≥11.0 mmol/L的合格小鼠進行實驗。將合格小鼠按體質(zhì)量分為模型組、陽性對照組（二甲雙胍0.25 g/kg）和紅曲石榴保健果醋高（10.0 mL/kg）、中（5.0 mL/kg）、低（2.5 mL/kg）劑量組，每組10只。每日按分組及設(shè)計劑量灌胃給藥（空白組與模型組給予等體積生理鹽水），給藥體積為10 mL/kg，每日1次；同時灌胃給予高脂高糖乳液（豬油20%、膽固醇10%、豬膽酸鈉0.5%、蔗糖20%）0.2 mL/只，連續(xù)灌胃30 d。各組小鼠末次給藥后1 h，眼眶取血，分離血清，按試劑盒說明書分別測定小鼠FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C含量及Ins活性，并計算胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，IAI），其計算公式如下：

IAI=1/（FBG×Ins）

（2）石榴紅曲保健果醋的體內(nèi)抗氧化功能研究

參考王元等[27-28]的方法，建立小鼠D-半乳糖氧化損傷模型。具體方法：取ICR小鼠，按體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組、陽性對照組（仙牌靈芝茶5.0 g/kg）和紅曲石榴保健果醋高（10.0 mL/kg）、中（5.0 mL/kg）、低（2.5 mL/kg）劑量組，每組10只。除空白組外，每組小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖生理鹽水溶液300 mg/kg（空白組注射等體積生理鹽水），連續(xù)注射30d。實驗期間按設(shè)計劑量和分組同步灌胃給藥（空白組與模型組給予等體積生理鹽水），給藥體積為10 mL/kg，每日1次。各組小鼠末次給藥后1 h，眼眶取血，分離血清，按試劑盒說明書分別測定血清中GSH、MDA含量及GSH-Px、CAT、SOD活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴紅曲保健果醋營養(yǎng)成分分析

2.1.1 氨基酸含量分析

石榴紅曲保健果醋中游離氨基酸組成及含量見表1。

表1 石榴紅曲保健果醋中游離氨基酸組成及含量Table 1 Composition and contents of free amino acid in pomegranate Monascus health fruit vinegar

續(xù)表

由表1可知，從石榴紅曲保健果醋中共檢測出17種氨基酸，其中9種為人體必需氨基酸（其中組氨酸為嬰幼兒的一種必需氨基酸），必需氨基酸含量占游離氨基酸總量的49%（＞40%），滿足聯(lián)合國糧農(nóng)組織（food and agriculture organization of the united nations，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）提出的理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[29]。石榴紅曲保健醋中各必需氨基酸在總氨基酸中的占比與FAO/WHO規(guī)范的氨基酸模式譜[29]進行比較，結(jié)果見表2。

表2 石榴紅曲保健果醋中人體必需氨基酸比例與模式譜比較Table 2 Comparison of proportion of essential amino acids in pomegranate Monascus health fruit vinegar and the amino acid pattern spectrum

由表2可知，各必需氨基酸占比均達(dá)到FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)，表明石榴紅曲保健果醋具有較好的營養(yǎng)價值。此外，甜味氨基酸丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、脯氨酸的總含量占游離氨基酸總含量的43.51%，芳香味氨基酸纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、精氨酸的總含量占游離氨基酸總含量的33.57%，這使得石榴紅曲保健果醋口感微甜，氣味清香，飲用有較好的口感，也可以作為調(diào)味品進行二次開發(fā)利用。

2.1.2 其他營養(yǎng)成分分析

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.163 3x+0.027 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 6；總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.007 4x+0.009 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 5；總酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.150 8x-0.012 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 5；R2均＞0.99，可用于石榴紅曲保健果酒中還原糖、總黃酮及總酚含量的測定。石榴紅曲保健果酒中還原糖、總酸、可溶性固形物、總黃酮及總酚含量的測定結(jié)果見表3。

表3 石榴紅曲保健果醋中其他營養(yǎng)成分含量Table 3 Content of other nutrients in pomegranate Monascus health fruit vinegar

由表3可知，石榴紅曲保健果醋中總酸含量為5.82 g/100 mL，可溶性固形物含量為10.67g/100mL，符合GB/T18187—2000《釀造食醋》要求；同時測得石榴紅曲保健果醋中活性成分還原糖含量為15.74 g/100 mL，總黃酮含量為8.25 mg/mL，總酚含量為20.82 mg/mL。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)查[30]，提示果醋中富含的總酚、總黃酮類物質(zhì)可能具有心血管活性及抗氧化的潛在活性，但需進一步功能學(xué)評價來驗證。

2.2 石榴紅曲保健果醋的功能學(xué)評價

2.2.1 石榴紅曲保健果醋的降糖、降脂活性研究

表4 石榴紅曲保健果醋對小鼠糖代謝及胰島素抵抗指數(shù)的影響Table 4 Effect of pomegranate Monascus health fruit vinegar on glucose metabolism and insulin resistance indexes in mice

由表4及表5可知，與空白組比較，經(jīng)小劑量注射四氧嘧啶和高脂高糖乳液喂養(yǎng)小鼠30 d后，模型組小鼠血清FBG、TC、TG和LDL-C含量顯著升高（P＜0.01），Ins活性（P＜0.05）和HDL-C含量（P＜0.01）顯著降低，小鼠胰島素敏感指數(shù)（IAI）顯著下降（P＜0.01），表明小鼠糖代謝和脂質(zhì)代謝均出現(xiàn)紊亂，建模成功。與模型組相比較，陽性對照組和石榴紅曲保健果醋均能降低小鼠FBG、TC、TG和LDL-C含量，升高HDL-C含量，提高機體的IAI敏感指數(shù)，其中高劑量（10.0 mL/kg）的石榴紅曲保健果醋效果明顯（P＜0.05），但對血清Ins活性沒有顯著影響（P＞0.05）。

表5 石榴紅曲保健果醋對小鼠脂質(zhì)代謝的影響Table 5 Effect of pomegranate Monascus health fruit vinegar on lipid metabolism of mice

2.2.2 石榴紅曲保健果醋的體內(nèi)抗氧化功能研究

表6 石榴紅曲保健果醋對小鼠抗氧化功能的影響Table 6 Effect of pomegranate Monascus health fruit vinegar on antioxidant function of mice

由表6可知，與空白組比較，經(jīng)連續(xù)30 d皮下注射D-半乳糖后，模型組小鼠血清中的SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH含量均顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01），表明模型小鼠體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)功能受損，建模成功。與模型組比較，陽性對照組和石榴紅曲保健果醋均能降低小鼠血清中MDA的含量，升高CAT、GSH-Px、SOD活性及GSH含量，其中高劑量（10.0mL/kg）石榴紅曲保健果醋效果顯著（P＜0.05），說明石榴紅曲保健具有較好的抗自由基損傷、降低脂質(zhì)過氧化物形成、增強機體抵抗氧化損傷的作用。

3 結(jié)論

本研究從石榴紅曲保健果醋中共檢測出17種氨基酸，總氨基酸含量為171.9 mg/100 g，其中9種為人體必需氨基酸，占游離氨基酸總量的49%，滿足FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，且各必需氨基酸占比均達(dá)到FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)。相關(guān)活性物質(zhì)檢測結(jié)果表明，石榴紅曲保健果醋營養(yǎng)豐富，總黃酮、總酚、還原糖、總酸和可溶性固形物的含量分別為8.25 mg/mL、20.82 mg/mL、15.74 g/100 mL、5.82 g/100 mL，18.67 g/100 mL。功能學(xué)評價結(jié)果表明，10.0 mL/kg石榴紅曲保健果醋能明顯降低高糖高脂小鼠血清中FBG、TC、TG和LDL-C含量，升高HDL-C含量，提高機體IAI，具有降血糖和血脂功能；明顯降低小鼠血清MDA含量，升高CAT、GSH-Px、SOD活性及GSH含量，具有體內(nèi)抗氧化活性。