李 棒，鄧夢(mèng)菲，陳延儒，萬(wàn) 茵，劉成梅，付桂明

（1.南昌大學(xué) 食品學(xué)院 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 國(guó)際食品創(chuàng)新研究院，江西 南昌 330047）

酵母是果酒釀造過程中決定果酒品質(zhì)、口感和風(fēng)味的關(guān)鍵因素[1-2]。傳統(tǒng)葡萄酒釀造過程中，除了釀酒酵母產(chǎn)酒精以外，常常伴有一些產(chǎn)酯（產(chǎn)香）酵母在發(fā)酵過程中起到增強(qiáng)特征果香味的作用[3]。有報(bào)道從各類水果果皮中篩得各種產(chǎn)酯酵母，包括戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）[4]、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）[5]、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）等[6-7]。同樣，在白酒釀造過程中，酒醅中微生物的代謝作用會(huì)產(chǎn)生豐富的微生物代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)直接或間接地形成了白酒突出而獨(dú)特的香氣風(fēng)味特征。其中產(chǎn)酯酵母對(duì)于提高酒中主體香氣（如乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯等）含量以及乙酸甲酯、辛酸乙酯等其他香氣物質(zhì)具有重要作用[8]，大部分香味物質(zhì)都具有明顯的果香特性，將其應(yīng)用于果酒釀造過程中能夠較好地改善果酒的香氣特性。徐麗萍等[8-9]分別從瀘州大曲和安徽古井大曲中篩選得到數(shù)株產(chǎn)酯酵母，并發(fā)現(xiàn)它們具有良好的發(fā)酵特性。

本研究通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期從藍(lán)莓果皮和特香型白酒酒醅中篩選得到的6株產(chǎn)酯酵母進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和發(fā)酵特性（生長(zhǎng)情況、產(chǎn)酒精、產(chǎn)總酯、耐受能力）研究，比較它們的發(fā)酵性能及對(duì)不同生長(zhǎng)環(huán)境的抗逆性和耐受性。旨在篩選出適合用于果酒發(fā)酵的產(chǎn)酯酵母，用于高酸度水果果酒的生產(chǎn)，以提高果酒品質(zhì)和改善酒的風(fēng)味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

分別從藍(lán)莓果皮（江西思科有限公司種植園）及特香型白酒酒醅（江西省樟樹市樟樹貢酒業(yè)有限公司）中先后篩得40株酵母，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)初步鑒定出6株產(chǎn)酯酵母，分別命名為E1～E6（菌株E1～E5來自特香型白酒酒醅，菌株E6來自藍(lán)莓果皮）。

1.1.2 化學(xué)試劑

酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物科技技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；蘋果酸、果糖（均為分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；酵母脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取抽提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，用蒸餾水溶解定容到1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeastextractpeptone dextrose agar，YPDA）培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基中加入20 g/L的瓊脂。

麥芽汁培養(yǎng)基：130 g/L麥芽浸粉，0.1 g/L氯霉素，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

模擬葡萄汁合成培養(yǎng)基：100 g/L葡萄糖，100 g/L果糖，1.5 g/L酵母提取物，0.3 g/L檸檬酸，5 g/L酒石酸，5 g/L蘋果酸，2 g/L硫酸銨，5 g/L磷酸二氫鉀，0.5 g/L硫酸鎂，0.2 g/L氯化鈉和0.05 g/L硫酸錳。用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液將培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至3.2。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-756P紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；PH50-3A43L-A光學(xué)顯微鏡：鳳凰光學(xué)股份有限公司；2720 Thermal Cycler 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FE28型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；ZDX-35BI型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；JA5003分析電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化及種子液的制備

菌株E1～E6在YPDA固體培養(yǎng)基上活化后，挑取酵母菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通過光學(xué)顯微鏡血球計(jì)數(shù)法計(jì)算菌體濃度，再將菌液用無(wú)菌水稀釋至菌濃度為1×107CFU/mL，制成種子液。

1.3.2 菌種的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌種活化后，液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用酵母DNA提取抽提試劑盒進(jìn)行菌株總DNA提取。利用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對(duì)酵母5.8S rDNA ITS區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[10]。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。所獲5.8S rDNA ITS區(qū)序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中利用Blast程序進(jìn)行核酸序列比對(duì)，采用MEGA5.0軟件中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

1.3.3 酵母菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將酵母種子液以1×105CFU/mL的接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，每隔4 h取1 mL菌液，血球計(jì)數(shù)法計(jì)算菌體濃度，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 酵母菌株發(fā)酵力的測(cè)定

采用CO2失重法[11]，將活化好的菌種按1×105CFU/mL接種量接入麥芽汁液體培養(yǎng)基，于26 ℃條件下靜置培養(yǎng)。每12 h測(cè)定1次質(zhì)量，培養(yǎng)7 d。以CO2失質(zhì)量為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制菌株發(fā)酵力曲線。

1.3.5 酵母產(chǎn)總酯能力測(cè)定

參照GB/T10345—2007《白酒分析方法》[12]，將酵母種子液以1×105CFU/mL的接種量接種于麥芽汁培養(yǎng)基中，單向出氣發(fā)酵栓密封，26 ℃靜置發(fā)酵7 d，采用皂化中和滴定法，測(cè)定總酯產(chǎn)量。

1.3.6 酵母菌的耐受性測(cè)定

參照吳啟鳳等[13]方法略有改進(jìn)后進(jìn)行酒精、SO2、pH和高糖耐受性測(cè)定。

（1）酵母耐酒精能力測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期酵母種子活化液，以5×105CFU/mL接種量接入不同酒精度（3%vol、6%vol、9%vol、12%vol、15%vol、18%vol、21%vol）的模擬葡萄汁合成培養(yǎng)基中，在26 ℃下靜置發(fā)酵培養(yǎng)3 d（每隔12 h振蕩懸浮一次），采用光學(xué)顯微鏡血球計(jì)數(shù)法測(cè)定各菌液的酵母細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)。

（2）酵母耐SO2能力測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期酵母種子活化液，以5×105CFU/mL接種量接入不同SO2質(zhì)量濃度（0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L）的葡萄汁合成培養(yǎng)基中，在26 ℃下靜置發(fā)酵培養(yǎng)3 d（每隔12 h振蕩懸浮一次），采用光學(xué)顯微鏡血球計(jì)數(shù)法測(cè)定各菌液的酵母細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)。

（3）酵母耐pH能力測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期酵母種子活化液，以5×105CFU/mL接種量接入不同pH值（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）的模擬葡萄汁合成培養(yǎng)基中，在26 ℃下靜置發(fā)酵培養(yǎng)3 d（每隔12 h振蕩懸浮一次），采用光學(xué)顯微鏡血球計(jì)數(shù)法測(cè)定各菌液的酵母細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)。

（4）酵母耐糖能力測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期酵母種子活化液，以5×105CFU/mL接種量接入不同糖含量（30%、40%、50%、60%、70%、80%）的葡萄汁合成培養(yǎng)基中，在26 ℃下靜置發(fā)酵培養(yǎng)3 d（每隔12 h振蕩懸浮一次），采用光學(xué)顯微鏡血球計(jì)數(shù)法測(cè)定各菌液的酵母細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013、Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析，MEGA5.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果分析

2.1 菌株的分子生物學(xué)鑒定

6株酵母的5.8S rDNA ITS區(qū)序列的NCBI比對(duì)結(jié)果見表1，將其構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹所得6株酵母菌株之間的親緣關(guān)系見圖1。由表1可知，在ITS區(qū)，菌株E1與異常畢赤酵母（Pichia anomala）相似性為99.32%，菌株E2與庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）相似性為100%，菌株E3與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）相似性為99.83%，菌株E4與光滑假絲酵母（Candida glabrata）相似性為99.65%，菌株E5與戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）相似性為99.22%，菌株E6與德巴利漢遜酵母（Debaryomyces hanseni）相似性為100%?？设b定菌株E1為異常畢赤酵母（P.anomala）、菌株E2為庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母（P.kudriavzevii）、菌株E3為異常威克漢姆酵母（W.anomalus）、菌株E4為光滑假絲酵母（Candida glabrata）、菌株E5為戴爾凱氏有孢圓酵母（T.delbrueckii）、菌株E6為德巴利漢遜酵母（D.hanseni）。由圖1可知，菌株E1（P.anomala）和E3（W.anomalus）位于同一小分枝，說明之間有很近的親緣關(guān)系，在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成同一類群，而其余菌株各自親緣關(guān)系差異明顯，各自形成獨(dú)立小分枝。在大分枝上菌株E1（P.anomala）、E2（P.kudriavzevii）、E3（W.anomalus）、E6（D.hanseni）親緣性靠近，屬于同一大分枝；菌株E4（Candida glabrata）、E5（T.delbrueckii）親緣性靠近，屬于同一大分枝。

表1 被測(cè)序菌株來源與相關(guān)菌株序列相似性Table 1 Sequence similarity between sequenced strains and related strains

圖1 基于5.8S rDNA ITS區(qū)基因序列的產(chǎn)酯酵母菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of ester-producing yeast strains based on 5.8S rDNA ITS region gene sequence

2.2 酵母菌的生長(zhǎng)曲線

對(duì)6株產(chǎn)酯酵母進(jìn)行生長(zhǎng)性能的測(cè)定并繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 6株產(chǎn)酯酵母菌生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of 6 strains of ester-producing yeast

由圖2可知，6株酵母均在0～8 h處于延滯期，8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而菌株E1（P.anomala）和E3（W.anomalus）在20 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，其余菌株均在32 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，其中菌株E1（P.anomala）和E3（W.anomalus）在44 h后開始進(jìn)入衰亡期。于洋等[14]認(rèn)為非釀酒酵母一般在發(fā)酵前期生長(zhǎng)旺盛，能夠產(chǎn)生較高含量的香氣物質(zhì)，但隨著酒精體積分?jǐn)?shù)的不斷升高其優(yōu)勢(shì)逐漸被釀酒酵母所替代。6株產(chǎn)酯酵母中，菌株E1（P.anomala）生長(zhǎng)速度最快，4 h結(jié)束延滯期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且能達(dá)到最高的菌體濃度，為10.5×108個(gè)細(xì)胞/mL，菌株E6（D.hanseni）生長(zhǎng)速度最慢，32 h才結(jié)束延滯期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，48 h時(shí)菌體濃度為9.2×108個(gè)細(xì)胞/mL。但生長(zhǎng)48 h菌體濃度最低的是E4（C.glabrata），僅為3.2×108個(gè)細(xì)胞/mL。劉燦珍等[15]研究發(fā)現(xiàn)，陸生伊薩酵母（Lssatchenkia terricola）、淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）、葡萄汁有孢漢遜酵母（H.uvarum）、美極梅奇酵母（M.pulcherrima）和戴爾有孢圓酵母（T.delbruecki）5株產(chǎn)酯酵母在0～5 h為延滯期，5～22 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，22 h后進(jìn)入平穩(wěn)期；原苗苗等[16]研究發(fā)現(xiàn)，H.uvarum、M.pulcherrima和T.delbruecki這三株產(chǎn)酯酵母在0～4 h為延滯期，4～14 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h后進(jìn)入平穩(wěn)期。產(chǎn)酯酵母的生長(zhǎng)速度存在一定差異，可能由于菌種個(gè)體差異及培養(yǎng)過程中基質(zhì)條件動(dòng)態(tài)變化引起的，菌株E1（P.anomala）生長(zhǎng)速度最快，有利于釀造過程快速起酵。

2.3 酵母菌的發(fā)酵力

發(fā)酵力反映酵母發(fā)酵糖產(chǎn)生酒精能力的大小，可以衡量產(chǎn)酯酵母在厭氧條件下生存能力。發(fā)酵力越強(qiáng)，表明酵母在厭氧情況下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯，在混合發(fā)酵前期能累積更多的香氣物質(zhì)。6株酵母菌發(fā)酵力測(cè)定結(jié)果見圖3。由圖3可知，6株酵母菌種普遍在發(fā)酵后0.5～1.5 d之間生長(zhǎng)最為旺盛。菌株E1（P.anomala）、菌株E3（W.anomalus）、菌株E4（T.delbrueckii）和菌株E5（C.glabrata）這4株菌株具有較強(qiáng)的發(fā)酵力，其中菌株E1（P.anomala）的發(fā)酵力最強(qiáng)，7 d最高總失質(zhì)量為1.30 g，在發(fā)酵初期（1 d）時(shí)失量高達(dá)1.18 g/d，而菌株E2（P.kudriavzevii）和E6（D.hanseni）發(fā)酵力較弱，7 d總失質(zhì)量分別為0.61 g和0.32 g，低于牛廣財(cái)?shù)萚17]所報(bào)道的釀酒酵母發(fā)酵力最高值（2.73 g/d）。結(jié)果表明，菌株E1具有最好的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能。

圖3 6株產(chǎn)酯酵母菌發(fā)酵力測(cè)定結(jié)果Fig.3 Determination results of fermentation abilities of 6 strains of ester-producing yeasts

2.4 產(chǎn)酯酵母產(chǎn)總酯能力

酯類物質(zhì)是果酒香氣物質(zhì)的主要組成成分之一，總酯的高低可以在一定程度上反映酵母產(chǎn)生香氣物質(zhì)的情況。對(duì)6株產(chǎn)酯酵母所產(chǎn)生的總酯進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株E1（P.anomala）和E4（C.glabrata）總酯產(chǎn)量分別為3.71 g/L和3.53 g/L，菌株E3（W.anomalus）產(chǎn)總酯能力最強(qiáng)，達(dá)3.91 g/L，菌株E6（D.hanseni）產(chǎn)酯能力最弱，僅為3.39 g/L。與許多研究報(bào)導(dǎo)的W.anomalus是產(chǎn)總酯能力強(qiáng)的酵母一致。史雁飛等[18]報(bào)道一株固定化后的W.anomalus所產(chǎn)總酯含量高達(dá)3.4 g/L。FAN G S等[19]報(bào)道W.anomalus能夠有效地改善發(fā)酵過程中的香味物質(zhì)，通過W.anomalus和Saccharomyces cerevisiae兩種酵母的協(xié)同發(fā)酵不僅提高了乙酸乙酯的產(chǎn)量，還增加了β-苯乙醇和苯乙基的含量，從而改善了白酒的風(fēng)味。菌株E3（W.anomalus）最高的產(chǎn)總酯能力可以為改善風(fēng)味提供更大地潛能。

表2 6株產(chǎn)酯酵母菌株產(chǎn)總酯結(jié)果Table 2 Results of total ester production capacity of 6 strains of ester-producing yeasts

2.5 產(chǎn)酯酵母耐受性比較

2.5.1 酒精耐受性比較

由圖4可知，在酒精耐受性方面，6株產(chǎn)酯酵母普遍在6%vol酒精度下能夠具有良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)酒精度＞9%vol之后生長(zhǎng)受到較大抑制，菌體生長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)顯著下降。其中菌株E1（P.anomala）對(duì)酒精耐受性最強(qiáng)，在9%vol酒精度下生長(zhǎng)狀態(tài)最好；菌株E6（D.hanseni）對(duì)酒精最敏感，在6%vol酒精度下生長(zhǎng)就基本被完全抑制。劉燦珍等[15]報(bào)道中產(chǎn)酯酵母的生長(zhǎng)隨著酒精度的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，且在酒精度到達(dá)6%vol時(shí)生長(zhǎng)量驟然下降，于洋等[14]也報(bào)道3株非釀酒酵母，東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）和季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondi）在酒精度到達(dá)6%vol之后抑制效果顯著。張莉等[20]認(rèn)為，耐酒精能力強(qiáng)的酵母菌株可以發(fā)酵更加完全、徹底。菌株E1（P.anomala）良好的酒精耐受性能，使其在果酒發(fā)酵中可維持良好的生存狀態(tài)，累積更多的香味物質(zhì)，滿足果酒釀造的需要[21]。

圖4 6株產(chǎn)酯酵母菌酒精耐受能力比較Fig.4 Comparison of alcohol tolerance of 6 strains of ester-producing yeasts

2.5.2 SO2耐受性比較

在果酒釀造過程中，適量SO2可以抑制某些微生物（包括乳酸菌和醋酸菌）的生長(zhǎng)，防止果酒的二次發(fā)酵和果酒的腐敗。但是SO2添加量太多會(huì)影響酵母的活性，使其發(fā)酵遲緩，酒體變苦[10]。因此，良好的SO2耐受性可以保證產(chǎn)酯酵母在發(fā)酵前期不受SO2添加量的影響。由圖5可知，6株酵母均在SO2＜200 mg/L的質(zhì)量濃度下能夠良好的生長(zhǎng)；當(dāng)SO2質(zhì)量濃度＞200 mg/L之后，6株酵母的生長(zhǎng)逐漸受到抑制，隨著SO2質(zhì)量濃度升高，抑制效果越顯著，其中菌株E5（T.delbrueckii）對(duì)SO2耐受性最強(qiáng)，300 mg/L SO2質(zhì)量濃度下仍能良好的生長(zhǎng)，菌株E3（W.anomalus）對(duì)SO2耐受性最弱，與張莉等[20，22]報(bào)道篩選釀酒酵母菌株研究結(jié)果相符。

圖5 6株產(chǎn)酯酵母SO2耐受能力比較Fig.5 Comparison of SO2 tolerance of 6 strains of ester-producing yeasts

2.5.3 pH耐受性比較

酵母酸度耐受性差可能導(dǎo)致發(fā)酵初期起酵速度緩慢，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)崆敖K止果酒發(fā)酵[1]。因此篩選出對(duì)低pH高耐受性的菌株對(duì)于果酒至關(guān)重要。藍(lán)莓果實(shí)中果汁的pH約為3.2，青梅、李子等水果pH約為3.0。對(duì)低pH的耐受性是優(yōu)良藍(lán)莓釀造酵母的重要值特性。由圖6可知，6株產(chǎn)酯酵母在pH 3.5～5.0能夠呈現(xiàn)良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，而產(chǎn)酯酵母E1（P.anomala）和E4（C.glabrata）pH耐受性最強(qiáng)，在pH 3.0的培養(yǎng)基中能良好的生長(zhǎng)，分別達(dá)到菌體濃度5.47×107個(gè)細(xì)胞/mL和6.17×107個(gè)細(xì)胞/mL。另外，菌株E6（D.hanseni）pH耐受性最差，只能在pH 4以上才能正常生長(zhǎng)。石陽(yáng)明等[23]從沙果和桃子中篩得8株產(chǎn)酯酵母在pH 2.5的條件下開始緩慢生長(zhǎng)，在pH 3.5之后生長(zhǎng)狀態(tài)良好，與本研究基本相符。

圖6 6株產(chǎn)酯酵母pH耐受性比較Fig.6 Comparison of pH tolerance of 6 strains of ester-producing yeasts

2.5.4 高糖耐受性比較

在一些甜型果酒釀造過程中，需要額外添加一定量的蔗糖保證發(fā)酵后的酒精度和甜度，但發(fā)酵醪糖度過高，會(huì)使酵母細(xì)胞處于高滲透壓環(huán)境，生長(zhǎng)受抑制。對(duì)糖度耐受性強(qiáng)的菌株可以更好地適應(yīng)環(huán)境，快速地生長(zhǎng)[14]。6株產(chǎn)酯酵母糖耐受性結(jié)果見圖7。

圖7 6株產(chǎn)酯酵母高糖耐受性比較Fig.7 Comparison of high sucrose tolerance of 6 strains of ester-producing yeast

由圖7可知，在糖度＜70%時(shí)受高糖抑制效應(yīng)影響較小，糖度＞70%則隨著蔗糖濃度升高抑制效果顯著增強(qiáng)，但菌株E2（P.kudriavzevii）在高蔗糖環(huán)境下生長(zhǎng)最好，菌株E6（D.hanseni）在高蔗糖環(huán)境下生長(zhǎng)最差。

3 結(jié)論

對(duì)前期從藍(lán)莓果皮及特香型白酒酒醅中篩得的6株產(chǎn)酯酵母進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，確定它們的種屬和物種親緣性。同時(shí)通過生長(zhǎng)曲線和發(fā)酵力的測(cè)定，比較了這6株產(chǎn)酯酵母好氧及厭氧情況下的生長(zhǎng)狀況及產(chǎn)氣能力。

結(jié)果表明，菌株E1（P.anomala）具有最快的生長(zhǎng)速度和最強(qiáng)的發(fā)酵力。通過產(chǎn)總酯能力比較發(fā)現(xiàn)，菌株E3（W.anomalus）產(chǎn)總酯能力最高達(dá)3.91 g/L，其次是菌株E1（P.anomala）總酯產(chǎn)量為3.71 g/L。菌株E1（P.anomala）對(duì)酒精耐受性最強(qiáng)，在9%vol酒精濃度下可以呈現(xiàn)良好生長(zhǎng)狀態(tài)；且在SO2＜200 mg/L的質(zhì)量度下，pH 3.0的培養(yǎng)基環(huán)境中，蔗糖含量＜70%時(shí)能夠良好的生長(zhǎng)。所以菌株E1（P.anomala）是具有突出的起酵、產(chǎn)總酯能力和較好的耐受性能菌株，可作為藍(lán)莓等高酸度水果果酒釀造的優(yōu)良產(chǎn)酯酵母菌株。