張振宇，楊海英，詹夢濤，陸小凱，杜 剛

（1.云南民族大學 民族藥資源化學國家民族事務委員會-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南民族大學化學與環(huán)境學院，云南 昆明 650500）

云南地處祖國西南邊陲，境內(nèi)崇山峻嶺、水系縱橫，低緯高原、南北落差顯著，造就了一山分四季，十里不同天的獨特立體氣候和豐富多彩的民族文化傳統(tǒng)[1-2]，歷來享有動植物王國、微生物資源寶庫的美譽。云南各地均有腌制（漬）保存食物的傳統(tǒng)，以民間小規(guī)模生產(chǎn)和家庭作坊生產(chǎn)為主，多屬自然發(fā)酵食品[3-5]，傳統(tǒng)腌制食品地域、食材、氣候類型、制作工藝的多樣性，為研究資源微生物帶來了諸多的可能性[6]。本研究選取云南多個地州傳統(tǒng)腌制食品6個品種共11份樣品進行可培養(yǎng)乳酸菌的分離鑒定及其發(fā)酵特性研究，以期從中獲得乳酸發(fā)酵優(yōu)勢菌株，為資源微生物開發(fā)及食品工業(yè)發(fā)酵提供線索與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6個品種11個樣品，采集自昭通、昆明、玉溪、西雙版納、楚雄、保山、德宏等7個地州用傳統(tǒng)工藝腌制的酸味濃郁、發(fā)酵成熟的農(nóng)家自制品[7-8]，見表1。

葡萄糖、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨、牛肉膏（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；酵母浸出汁（生化試劑）：上海天鵝啤酒有限公司；吐溫-80（化學純）、檸檬酸三銨、乙酸鈉、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、碳酸鈣（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

表1 樣品的信息Table 1 Information of samples

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸出汁5 g，吐溫-80 1 mL，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉1 g，硫酸錳0.25g，硫酸鎂0.58g，磷酸二氫鉀2g，蒸餾水1000mL，pH自然。

產(chǎn)酸菌株篩選平板：MRS液體培養(yǎng)基添加2%瓊脂、2%碳酸鈣、0.04%溴甲酚紫。

1.2 儀器與設備

ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；XSP-10C雙目顯微鏡：上海光學儀器廠；TGL-15B高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；Eppendorf 5331聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Eppendorf公司；GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離和鑒定

無菌條件下，稱取10 g腌制樣品加入90 mL無菌生理鹽水中，勻漿后進行10倍梯度稀釋，選取適宜的濃度梯度，用涂布法接種于MRS培養(yǎng)基進行微生物分離[9]。32 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h[10]，隨機挑取菌落，多次平板劃線獲得純培養(yǎng)，挑取單菌落接種于產(chǎn)酸菌株篩選平板中央，于32 ℃恒溫培養(yǎng)，篩選出產(chǎn)生黃色透明水解圈的菌株[11]。

1.3.2 菌株細胞形態(tài)觀察

將分離獲得的菌株進行革蘭氏染色并顯微觀察細胞形態(tài)，采集細胞圖像[12]。

1.3.3 菌株生理生化試驗

將分離獲得的菌株進行明膠液化試驗、產(chǎn)H2S試驗、吲哚試驗、過氧化氫酶試驗、葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)氣、七葉苷水解、淀粉水解等生理生化試驗[13-15]。

1.3.4 菌株分子生物學鑒定

將分離獲得的菌株用MRS平板純化培養(yǎng)3次，接種于30 mL MRS液體培養(yǎng)基，32 ℃培養(yǎng)24 h，取5 mL培養(yǎng)物于12 000 r/min離心10 min，收集菌體，用液氮凍融-十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。采用通用引物27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、1495r：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'，以基因組DNA為模板進行16S rDNA擴增。PCR擴增體系：TaqMIX 12 μL，引物各1 μL，模板2 μL，加無酶水補足20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預熱5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，經(jīng)30個循環(huán)后72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京梓熙生物科技有限公司進行純化、測序，序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）基因庫中進行同源性比對，用MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.5 菌株發(fā)酵特性研究

將10株乳酸菌活化后，分別接種于裝有200 mL MRS培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶，每個菌株做3個平行，置32 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)[16-18]。于12 h、24 h、48 h、72 h、96 h定時取樣測定發(fā)酵液中的乳酸、殘?zhí)?，作出產(chǎn)酸曲線、降糖曲線，對菌株發(fā)酵特性進行初步表征[19-20]。

1.3.6 乳酸的測定

用EDTA絡合滴定法[9]對發(fā)酵液中乳酸鈣進行滴定，按照以下公式進行乳酸換算：

式中：W乳酸表示乳酸的質(zhì)量濃度，g/L；M乳酸表示乳酸的摩爾質(zhì)量，90.08 g/mol；CEDTA表示EDTA標準溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；VEDTA表示滴定消耗EDTA標準溶液的體積，mL；V樣表示量取發(fā)酵液樣品的體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離結(jié)果

用梯度稀釋-平板培養(yǎng)法對自然發(fā)酵成熟的11個樣品分別進行菌株分離，盡可能多的挑取菌落形態(tài)不同的細菌獲得純培養(yǎng)，進而用產(chǎn)酸菌株篩選培養(yǎng)基對純培養(yǎng)菌株進行復篩，以平板上變色-溶鈣圈出現(xiàn)的時間、大小為指標，獲得優(yōu)勢產(chǎn)酸菌株10株。

2.2 菌株鑒定結(jié)果

經(jīng)革蘭氏染色等試驗，10株產(chǎn)酸菌株菌落形態(tài)特征描述見表2。

表2 10株菌株的菌落形態(tài)Table 2 Colony morphology of 10 strains

對分離菌株菌落形態(tài)特征與細胞形態(tài)觀察，結(jié)合生理生化試驗，參照《伯杰細菌鑒定手冊》、《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》，初步判斷10株產(chǎn)酸菌均為乳酸菌，其中桿菌9株、球菌1株。生理生化試驗結(jié)果見表3。

表3 10株菌株的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of 10 strains

菌株16S rDNA序列PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像見圖1。擴增產(chǎn)物送至北京梓熙生物科技有限公司進行測序，序列在NCBI GenBank庫中進行同源性比對，用MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，見圖2。將10株產(chǎn)酸菌株進行鑒定，結(jié)果見表4。由表4可知，10株菌分別屬乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串球菌屬（Leuconostoc）、腸球菌屬（Enterococcus），其中4株為戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）。

圖1 16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of 16S rDNA PCR product

經(jīng)鑒定，菌株1116b、1125b、1126b、1127b被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株1128b被鑒定為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），菌株1097b被鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），菌株1119b被鑒定為哈爾濱乳桿菌（Lactobacillus harbinensis），菌株1133b被鑒定為戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus），菌株1089b被鑒定為腸系膜明串球菌（Leuconostoc mesenteroides），菌株1129b被鑒定為糞腸球菌（Enterococcus faecium）。

圖2 基于16S rDNA序列10株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 10 strains based on 16S rDNA sequences

表4 10株菌株的鑒定結(jié)果Table 4 Identification results of 10 strains

2.3 菌株發(fā)酵特性研究

對純培養(yǎng)的10株乳酸菌進行初步發(fā)酵實驗，作出產(chǎn)酸曲線見圖3、降糖曲線見圖4。

圖3 10株菌株發(fā)酵產(chǎn)乳酸曲線Fig.3 Curve of lactic acid production by 10 strains

圖4 10株菌株發(fā)酵降糖曲線Fig.4 Curve of glucose consumption by 10 strains

由圖3、圖4可知，各菌株發(fā)酵特性差異較顯著：菌株1119b發(fā)酵過程中產(chǎn)酸量一路平穩(wěn)上升，但發(fā)酵終點乳酸產(chǎn)量較低、殘?zhí)橇枯^高；菌株1126b在發(fā)酵開始至24 h時即出現(xiàn)產(chǎn)酸速率的最大值，隨后增長趨勢減緩，發(fā)酵終點乳酸產(chǎn)量較高、殘?zhí)橇枯^低；菌株1097b、1129b發(fā)酵前期增長迅速，后期則表現(xiàn)出明顯的減緩趨勢，發(fā)酵終點乳酸產(chǎn)量處于中間水平；菌株1127b具有最高的發(fā)酵終點乳酸濃度及較低的殘?zhí)橇?，其發(fā)酵過程具有最高的轉(zhuǎn)化率。

總體來看，10株菌均有較強的產(chǎn)酸能力，乳酸產(chǎn)量為40.84～71.82 g/L，殘?zhí)呛吭?.04～20.04 g/L，乳酸轉(zhuǎn)化率為40.84%～71.82%，其中8株表現(xiàn)出同型或混合型乳酸發(fā)酵，其余2株表現(xiàn)出異型或混合型乳酸發(fā)酵。

3 結(jié)論

本研究通過對云南傳統(tǒng)腌制食品進行菌株分離、定向篩選，結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化實驗、分子生物學鑒定等實驗，分離得到3個屬10個種乳酸菌，說明云南傳統(tǒng)發(fā)酵食品中可培養(yǎng)乳酸菌多樣性豐富，是潛在的乳酸菌來源。通過進一步的乳酸發(fā)酵實驗，表明所分離菌株代謝類型多樣，且以具有優(yōu)良產(chǎn)酸性能的同型發(fā)酵為主，部分菌株表現(xiàn)出潛在的乳酸發(fā)酵應用價值，為資源微生物的開發(fā)利用提供了新的線索。