程 敏，溫明新

（1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東250012；2.山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

近10 年來，隨著傳染病的發(fā)病率持續(xù)升高[1‐4]，特別是呼吸系統(tǒng)傳染病的多發(fā)[5‐7]，醫(yī)務(wù)人員逐漸成為院內(nèi)呼吸道傳染病的高危人群。因呼吸系統(tǒng)傳染病的傳染源是病人或病原體攜帶者，通過飛沫經(jīng)由呼吸道傳播，傳染性強(qiáng)，傳播速度快[8‐9]，所以醫(yī)務(wù)人員需要進(jìn)行有效的自我防護(hù)。在這種情況下，口罩成為了醫(yī)務(wù)人員最常用的防護(hù)工具[10]。目前醫(yī)務(wù)人員常用的口罩有醫(yī)用外科口罩和一次性口罩兩種，而如何選擇口罩，醫(yī)務(wù)人員存在著一定的分歧?；诖耍狙芯科谕ㄟ^實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜃C實(shí)兩種口罩在防護(hù)能力上存在的區(qū)別，期望為醫(yī)務(wù)人員提供確切的選擇依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺支氣管上皮細(xì)胞（BEAS‐2B）選擇DMEM 高糖培養(yǎng)基（10% 胎牛血清，1% 青鏈霉素），在孵育箱中，溫度37 ℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。傳代時(shí)先吸取上清，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗兩遍，37 ℃，0.25%胰酶消化3 min，正常培養(yǎng)基終止消化，以1 000 r/min 離心5 min 后收集細(xì)胞，去掉上清，加入正常培養(yǎng)基，按照1∶3 傳代。凍存液配方按照培養(yǎng)基：血清∶二甲基亞楓（DMSO）=5∶4∶1 配制。

1.2 條件培養(yǎng)基制備與分組 收集香煙煙霧的裝置經(jīng)過乙醇擦拭后，在生物安全柜中與香煙一起用紫外燈照射30 min 滅菌，煙霧收集后經(jīng)過不同的口罩濾過后吹入BEAS‐2B 培養(yǎng)基中，并標(biāo)注。根據(jù)培養(yǎng)基不同分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)基）、一次性口罩組和醫(yī)用外科口罩組。

1.3 噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn) 按照1 500個(gè)/孔，BEAS‐2B細(xì)胞接種在96 孔板中，加入正常培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基，每組6 個(gè)復(fù)孔，生長(zhǎng)72 h 后，加入MTT，孵育箱培養(yǎng)4 h，取出去掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩5 min，酶標(biāo)儀讀取570 nm 波長(zhǎng)的吸光度。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn) 按照1 500 個(gè)/孔BEAS‐2B 細(xì)胞接種在6 孔板中，分別加入正常培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基，每組3 個(gè)復(fù)孔，正常培養(yǎng)；2 周后，取出培養(yǎng)板，去掉上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2遍，加入甲醇固定30 min，去掉甲醇，PBS 清洗2遍，加入考馬斯亮藍(lán)染色2 h，清水沖洗后晾干。

1.5 蛋白質(zhì)提取 100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)的BEAS‐2B，在80%密度時(shí)，將培養(yǎng)皿置于冰上，吸掉上清液，PBS清洗2 遍，加入500 μL 強(qiáng)放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液靜置5 min，細(xì)胞刮刀刮下轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，14 000 r/min，4 ℃離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL EP管中，加入聚丙烯酰胺凝膠電泳（5xSDS‐PAGE）緩沖液稀釋至1x，98 ℃加熱5 min，分裝，?20 ℃保存。

1.6 蛋白質(zhì)印記法（Western blot） 配制12% 分離膠，6%濃縮膠，20 μL 樣品，電壓80 V 濃縮膠，120 V 分離膠，100 V 恒壓轉(zhuǎn)膜40 min，5%胎牛血清封閉1 h，抗體Actin（1∶2 000），活性半胱氨酸蛋白酶3（cleaved cas‐pase 3，1∶1 000），活性半胱氨酸蛋白酶8（cleaved cas‐pase 8，1∶1 000），增殖細(xì)胞核抗原（Ki‐67，1∶1 000）4 ℃孵育過夜。第2 天，二抗孵育后化學(xué)發(fā)光液（ECL）顯影。

2 結(jié)果

2.1 3 組細(xì)胞增殖能力比較 與對(duì)照組相比，醫(yī)用外科口罩條件培養(yǎng)基組BEAS‐2B 細(xì)胞增殖受到抑制（P＜0.05），但是一次性口罩條件培養(yǎng)基組BEAS‐2B 細(xì)胞增殖與對(duì)照組相比，受到的抑制更為明顯（P＜0.01），且與醫(yī)用口罩條件培養(yǎng)基組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot 檢測(cè)Ki‐67 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。見圖1、圖2。

圖1 MTT 檢測(cè)BEAS‐2B 在不同條件培養(yǎng)基中增殖能力

圖2 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67 的表達(dá)

2.2 3 組細(xì)胞活性比較 與對(duì)照組相比，醫(yī)用外科口罩條件培養(yǎng)基組BEAS‐2B 細(xì)胞活性受到抑制（P＜0.05），但是一次性口罩條件培養(yǎng)基組BEAS‐2B 細(xì)胞增殖與對(duì)照組相比受到抑制更為明顯（P＜0.01），而且與醫(yī)用口罩條件培養(yǎng)基組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同條件培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞活性的影響

2.3 3 組細(xì)胞凋亡情況比較 與對(duì)照組相比，醫(yī)用外科口罩條件培養(yǎng)基組BEAS‐2B 細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白活性cleaved caspase 3 和8 表達(dá)升高（P＜0.05），但是一次性口罩條件培養(yǎng)基組這兩個(gè)蛋白升高更為明顯（P＜0.01），而且與醫(yī)用外科口罩條件培養(yǎng)基組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 Western blot 檢測(cè)不同條件培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（Actin 為內(nèi)參）

3 討論

呼吸系統(tǒng)相關(guān)的衛(wèi)生事件多發(fā)，常見的流行性感冒、風(fēng)疹、流行性腮腺炎、水痘[11‐13]，以及更為危險(xiǎn)的重癥急性呼吸綜合征（SARS）[14]、新型冠狀病毒肺炎等，這些傳染病主要通過呼吸道傳播，因此呼吸道的防護(hù)成為對(duì)抗這些疾病的基本且有效的措施。本研究結(jié)果顯示，兩種口罩濾過后的香煙煙霧融入到培養(yǎng)基中，都能夠抑制正常肺上皮細(xì)胞的增殖和活性，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是醫(yī)用外科口罩對(duì)細(xì)胞的影響較小，也就是說，雖然兩種口罩都不能做到完全有效防護(hù)，但是醫(yī)用外科口罩的防護(hù)能力明顯高于一次性口罩。

在正常工作中，醫(yī)護(hù)人員感染呼吸道病毒的病例不在少數(shù)[15]。盡管醫(yī)護(hù)人員要求在進(jìn)行高感染風(fēng)險(xiǎn)醫(yī)療活動(dòng)或準(zhǔn)備進(jìn)入隔離病房時(shí)需配戴口罩，平時(shí)工作中是否需要佩戴口罩并沒有明確的要求[16]。但是沒有癥狀的病毒攜帶者也是重要的傳染源，因此醫(yī)護(hù)人員在工作過程中全程佩戴口罩是很有必要的，而且要盡量選擇醫(yī)用外科口罩，以保證有更好的防護(hù)效果。