于德涵，黎 莉，蘇 適，王廣慧

(綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061)

銀杏(GinkgobilobaL.)又名白果，為銀杏科銀杏屬落葉喬木[1]，葉子是傳統(tǒng)的中草藥，為我國特產(chǎn)植物。銀杏集藥用、食用、材用價(jià)值于一體，銀杏葉具有200多種藥用成分，從銀杏葉中分離得到的黃酮已多達(dá)40多種，黃酮類化合物發(fā)揮了重要的藥理作用，藥理實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明銀杏葉黃酮具有促進(jìn)人體血液循環(huán)、抑制血小板活化因子、抗氧化、防止衰老過敏、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和脂質(zhì)代謝、抗腫瘤、預(yù)防老年癡呆癥[2-7]等作用。目前銀杏葉中黃酮藥理活性廣泛且，在藥品、化妝品、保健品、生物農(nóng)藥等方面有諸多應(yīng)用，銀杏葉中黃酮主要存在于細(xì)胞壁內(nèi)，但是傳統(tǒng)方法提取效率低且耗時較長[8-9]，制約了銀杏葉黃酮的應(yīng)用。本文采用超聲提取方法提取銀杏葉中黃酮，可有效破壞銀杏葉細(xì)胞壁，并用響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，對銀杏葉黃酮的繼續(xù)開發(fā)和利用提供了理論支持。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

銀杏葉(飲片級)，勝亳生物科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，北京譜析科技有限公司；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉(試劑均為分析純)，國藥試劑有限公司；去離子純水，自制。

1.2 儀器設(shè)備

PS-20AD超聲波清洗器，深圳市良誼實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；SHZ-DIII循環(huán)水式多用真空泵，上海科升儀器有限公司；101-0A鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；V-5100B紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取0.005 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，得到質(zhì)量濃度為50 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，置于6個10 mL的容量瓶中，先后加入30%乙醇5 mL 5%，NaNO20.3 mL，靜置10 min，再加10%的Al(NO3)30.3 mL，靜置6 min，加2 mL 4%NaOH，最后用30%乙醇定容至刻度，搖勻靜置10 min。分別在510 nm處測量吸光度，以蘆丁濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.023X+0.069，R2=0.9992。

1.3.2 銀杏葉黃酮提取率的計(jì)算

將銀杏葉用蒸餾水洗凈，烘干，粉碎，過60目篩，得銀杏葉粉末，放入避光處保存。稱取一定質(zhì)量的銀杏葉粉，在55 ℃下，超聲功率400 W，按料液比1:30(g/mL)，一定濃度的乙醇溶液為提取劑，提取時間，提取溫度超聲提取，過濾得銀杏葉黃酮提取液。

按下式計(jì)算銀杏葉總黃酮提取率。

1.4 銀杏葉中黃酮提取工藝優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取銀杏葉粉末3.0 g，采用超聲輔助法提取銀杏葉中黃酮，固定料液比1:30(g/mL)、超聲功率400 W，分別考察乙醇濃度(40%，50%，60%，70%，80%)、超聲時間(20、30、40、50、60 min)、提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)三個因素對銀杏葉中黃酮提取率的影響。

1.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選取乙醇濃度(A)、超聲時間(B)、提取溫度(C)，以銀杏葉黃酮提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken Design中心組合設(shè)計(jì)原理，優(yōu)化銀杏葉黃酮提取工藝，以黃酮的提取率為響應(yīng)值，建立響應(yīng)回歸模型，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素分析

2.1.1 乙醇濃度對提取率的影響

圖1 乙醇濃度對提取率的影響

由圖1可知，乙醇濃度在40%～80%之間時，銀杏葉黃酮的提取率先增大而后下降，當(dāng)乙醇濃度為70%時，提取率達(dá)到最高；隨后開始下降。原因可能是銀杏葉黃酮在60%～70%乙醇中已經(jīng)大部分溶出，如果乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，過量乙醇會將銀杏葉中的其他雜質(zhì)成分溶出，導(dǎo)致了黃酮得率下降[10]。因此，乙醇濃度選擇70%。

2.1.2 提取時間對提取率的影響

圖2 提取時間對提取率的影響

由圖2可知，隨提取時間在20～60 min之間時，銀杏葉黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)提取時間為40 min時，黃酮的提取率最高；隨后提取率開始下降。原因可能是時間過長超聲波的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，破壞了銀杏葉黃酮結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[11]，導(dǎo)致其提取率下降。因此，提取時間選擇40 min。

2.1.3 提取溫度對提取率的影響

圖3 提取溫度對提取率的影響

由圖3可知，提取溫度在40～80 ℃時，銀杏葉中黃酮的提取率先增大后下降，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時，提取率最高。原因可能是溫度升高，分子運(yùn)動加速，細(xì)胞破裂加快有利于黃酮的溶出，但是繼續(xù)升高溫度，過高溫度會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)[12]，提取率下降。因此，選擇提取溫度60 ℃。

2.1.4 液料比對提取率的影響

圖4 液料比對提取率的影響

由圖4可知，料液比在1:20 mL/g時，銀杏葉中黃酮提取率達(dá)到最大值，但料液比繼續(xù)增大，黃酮提取率呈下降趨勢。原因可能是當(dāng)液料比過小時，體系內(nèi)少量溶劑無法將銀杏葉粉末完全潤濕，黃酮化合物溶出不完全；隨著液料比的增加，過量的乙醇溶劑會造成后處理中黃酮含量的損失[13]，從而降低了銀杏葉黃酮的提取量。因此，銀液料比選擇 1:20 mL/g。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果討論

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

2.2.2 回歸方程和方差分析

采用Design-Expert8.0.6軟件對響應(yīng)值和各因素進(jìn)行回歸擬合，以銀杏葉黃酮提取率(Y)為響應(yīng)值，得到各因子的二次回歸擬合方程為：

Y=+5.00+0.22A-0.21B-0.087C-2.000E-003AB+0.065AC-9.750E-003BC-0.24A2-0.12B2+0.12C2，方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析表

注：P>0.05為不顯著；P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著。

由表3可知，根據(jù)回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)，P<0.0001，說明二次多項(xiàng)式模型達(dá)到極顯著水平；失擬值P=0.5418>0.05，沒有顯著差異，表明該二次曲面能很好的擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；確定系數(shù)R2=0.9865，說明模型方程與實(shí)驗(yàn)擬合程度好，實(shí)驗(yàn)誤差小?；貧w模型一次項(xiàng)A和B極顯著(P<0.01)，C顯著(P<0.05)；交互項(xiàng)AC為模型顯著因素(P<0.05)；二次項(xiàng)A2、B2和C2為模型極顯著因素(P<0.01)。方差分析中，各因素對銀杏葉黃酮得率影響的順序?yàn)椋阂掖紳舛?超聲時間>提取溫度。綜上所述，該模型可用于分析和預(yù)測銀杏葉黃酮的提取率，并確定最佳提取工藝條件。

2.2.3 響應(yīng)面分析

采用Box-Behnken 軟件對乙醇濃度、提取時間和提取溫度之間兩兩交互作用的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖

使用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件分析，將三因素兩兩進(jìn)行分析比較，做出響應(yīng)面曲線圖，結(jié)果見圖5。響應(yīng)曲面圖能直觀地反映各因素之間的作用對響應(yīng)值的影響。由圖5可知，超聲時間，提取溫度相對于乙醇濃度曲線陡峭，說明提取時間和提取溫度對銀杏葉中黃酮的提取影響較顯著。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過上述響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析，得到最佳的提取工藝為：乙醇濃度63.13%，超聲時間31.49 min，提取溫度50 ℃，理論預(yù)計(jì)值5.316%?？紤]到實(shí)際操作中的局限性，最終選擇醇濃度63%，超聲時間32 min，提取溫度50 ℃，進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，提取率平均值為5.328%，與模型的預(yù)測值基本吻合，說明預(yù)測模型與實(shí)際情況擬合較好，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取銀杏葉中黃酮，得到最佳工藝條件為：乙醇濃度63%、提取溫度50 ℃、提取時間32 min，取率可達(dá)5.328%，回歸模型擬合度較高。與傳統(tǒng)提取工藝相比，提取效果好，優(yōu)選了銀杏葉黃酮的提取條件，是一種高效提取銀杏葉黃酮的方法，可用于保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，為今后相關(guān)的研究提供了參考。