周 蓉，曹 峰，劉 楊，陳開宇，郭宇弘，王雅霞

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp以下簡稱)是一種從胃黏膜內(nèi)分離出來的螺旋狀彎曲桿菌，與許多惡性腫瘤和非惡性疾病相關(guān)[1]，被國際癌癥機構(gòu)列為第一類致癌因子[2]，在人群中傳播，全球人群感染率高達(dá)50%以上[3-4]，嚴(yán)重影響人類健康。目前認(rèn)為幽門螺旋桿菌感染是能夠預(yù)防胃癌最重要且可控的一個危險因素[5]。Hp感染關(guān)乎我國國計民生，更是消化科的熱點，而根除它并非易事，抗生素的廣泛應(yīng)用使得治療出現(xiàn)了瓶頸[6]，非抗生素的治療越來越被研究者重視，目前已發(fā)現(xiàn)一些中藥在Hp根除治療中有可觀的療效，中藥抗Hp研究也在醫(yī)學(xué)界備受關(guān)注[7]，中國幽門螺旋桿菌治療共識建議考慮將中藥用于Hp根除。基于對地區(qū)環(huán)境及當(dāng)?shù)鼐用耋w質(zhì)與前期研究等發(fā)現(xiàn)茯苓甘草湯能有效改善胃腸不適的癥狀，故開展茯苓甘草湯對Hp感染的研究。本文主要進(jìn)行體外的抑菌實驗研究，分析茯苓甘草湯及方中有效成分體外抑菌作用，探討其治療Hp的作用機制，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 動物及菌株

動物：12只SD雌性大鼠，體重為180～220 g，由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2019-0014。

菌株：Hp SS1菌株，來自國家疾病控制和預(yù)防中心。

1.2 藥物與材料

藥物：實驗所用到中藥購于貴州同濟(jì)堂藥房：炙甘草片(生產(chǎn)批號：19060101)、茯苓(生產(chǎn)批號：1905101)、桂枝(生產(chǎn)批號：C190423)、肉桂(生產(chǎn)批號：C190426)、生姜購于農(nóng)貿(mào)市場。

材料：哥倫比亞血培養(yǎng)基(生產(chǎn)編號：HB0124)、幽門螺旋桿菌添加劑(生產(chǎn)編號：HB8646a)、腦心浸液(生產(chǎn)編號：HB8297-1)、尿素酶試劑 (生產(chǎn)編號：GS004)、氧化酶試紙(生產(chǎn)編號：HB2100)、革蘭染色試劑盒(生產(chǎn)編號：HB878)均購于青島海博；無菌脫纖維羊血由河南巨石生物有限公司提供；麥?zhǔn)媳葷峁苡森h(huán)凱生物有限公司提供；厭氧培養(yǎng)盒、微需氧產(chǎn)氣袋來自日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社；游標(biāo)卡尺。

1.3 主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠) 、恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)、電子天平(日本島津)、CX21型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司提供)、高壓滅菌鍋(上海安亭)、無菌操作臺等。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基制備

固體培養(yǎng)基由哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基每93 mL加1支1 mL幽門螺旋桿菌添加劑作為抗生素+7%無菌脫纖維羊血，傾入無菌平皿。保存液制備：腦心浸液加30%甘油高壓滅菌冷卻，每1 mL分裝入無菌保存管中。4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 Hp鑒定及菌液制備

在制作好的固體培養(yǎng)基上涂布平板法接種Hp菌液后放入微需氧環(huán)境下37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，超凈工作臺下打開后肉眼觀察菌落生長情況，革蘭染色顯微鏡下觀察菌體形狀，快速尿素酶試驗、氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗等方法檢測細(xì)菌情況。檢測結(jié)果均為陽性后將細(xì)菌進(jìn)行保存，濃度用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，即每管保存液中?xì)菌濃度為1×108CFU/mL。

2.3 中藥水煎液制備

將茯苓、炙甘草、生姜、桂枝、肉桂單味中藥及茯苓甘草湯原方、肉桂方各藥劑量按經(jīng)方比例3∶2∶2∶1配制換算，8倍蒸餾水浸泡30 min后煎煮30 min，再用6倍雙蒸水浸泡煎煮2次，將3次煎液合并后用雙層紗布過濾，80 ℃熱水浴揮發(fā)濃縮至1∶1水煎液，最后得水煎液中含生藥量為1 g/mL。放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法測抑菌圈直徑

取6 mm無菌空白藥敏紙片加入1 mL中藥水煎液，浸泡過夜后取出紙片于干燥無菌管中密封，放入50～60 ℃烘干箱中干燥，直至干燥完全。取濃度為1×108CFU/mL的Hp保存液100 μL，用一次性L棒充分涂勻平板，待菌液干燥后等間距的放置4個藥敏紙片，將平板倒放在裝有微需氧產(chǎn)氣袋的厭氧培養(yǎng)盒中，充分密封后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h后取出，測量抑菌圈直徑，同種藥物重復(fù)5次。

2.5 打孔法測抑菌圈直徑

用L棒均勻涂布濃度為1×108CFU/mL的Hp保存液100 μL于哥倫比亞血平板上，待菌液稍干燥后，用打孔的方法在平板上等間距打上直徑為6 mm的小孔，每個小孔用移液槍注入不同藥物水煎液50 μL，微需氧環(huán)境下恒溫培養(yǎng)72 h后測抑菌圈直徑，同種藥物重復(fù)3次。

2.6 抗生素敏感度判定標(biāo)準(zhǔn)(抑菌圈直徑標(biāo)準(zhǔn))

高敏抑菌作用的抑菌圈直徑>15 mm；中敏感度抑菌的抑菌圈直徑10～15 mm；低敏感度的抑菌圈直徑5～10 mm；無抑菌效果的抑菌圈為直徑<5 mm或者無明顯抑菌圈。

3 實驗結(jié)果

3.1 Hp檢測鑒定

用接種環(huán)挑取培養(yǎng)72 h后血平板上的少量菌落，快速尿素酶試驗在約2 min左右變?yōu)槊导t色(圖1A)，白色氧化酶試紙蘸有細(xì)菌后立即變藍(lán)色(圖1B)，觸酶試驗立即產(chǎn)生大量氣泡(圖1C)，革蘭染色顯微鏡下觀察，有螺旋狀、海鷗狀，少量可見球狀或桿狀的革蘭陰性菌(圖1D)。顯微鏡下觀察的形狀與Hp相似，快速尿素酶試驗、氧化酶試驗、觸酶試驗均呈陽性，符合Hp理化性質(zhì)，提示Hp培養(yǎng)成活。

3.2 藥物水煎液抑菌作用的結(jié)果

藥敏紙片法(見圖2)測定茯苓甘草湯及單味中藥抑菌圈直徑結(jié)果見表1，打孔法抑菌圈直徑結(jié)果見表2，綜合兩種測抑菌圈直徑方法的結(jié)果可得出，甘草、生姜、茯苓甘草湯原方、肉桂方體外抑制Hp有中敏感度抑菌作用，桂枝、肉桂對Hp的抑菌作用較低，茯苓對Hp體外藥敏紙片法抑菌中未見明顯抑菌圈，打孔法邊緣均有不同程度的Hp生長，由此判斷茯苓對Hp無明顯抑菌作用，將高敏和中敏視為敏感可得炙甘草、生姜、茯苓甘草湯原方及肉桂方為敏感。

注：鑒定結(jié)果：A.快速尿素酶試驗陽性；B.氧化酶試驗陽性；C.觸酶試驗陽性；D.顯微鏡觀察(×100)

圖1 Hp生化鑒定結(jié)果和顯微鏡

中醫(yī)用藥遣方主要講究君臣佐使的配伍，通過藥物復(fù)方之間相互作用來改善機體，在機體內(nèi)產(chǎn)生藥理效應(yīng)，而單純的藥物水煎液未經(jīng)過代謝的過程，無法真實反映體內(nèi)量效關(guān)系，體外抑菌與體內(nèi)殺菌存在一定程度的差距，為全面了解茯苓甘草湯對Hp的作用機制，在藥物水煎液抑菌的基礎(chǔ)上給動物灌入不同濃度方藥水煎液后，在血清含藥量達(dá)高峰時取動物含藥血清進(jìn)行體外抑菌實驗。

3.3 含藥血清抑菌測定

將茯苓甘草湯原方及肉桂方按劑量比例大小分為高、中、低劑量(40 g/kg；20 g/kg；10 g/kg)給大鼠灌胃連續(xù)7 d，后1 d連續(xù)2次灌胃，中間間隔2 h，末次給藥3 h后腹主動脈采血放置1 h，離心抽取血清，滅活除菌，制備出含藥血清，用打孔法(如圖3)測定含藥血清對Hp的抑菌作用，每組血清重復(fù)5次。結(jié)果如表3所示，得出茯苓甘草湯原方不同劑量對Hp的抑菌無明顯差距，茯苓甘草湯肉桂方的高劑量較中、低劑量抗Hp敏感，原方的不同劑量與肉桂方中的高劑量均為中敏感度抑菌作用，可將茯苓甘草湯原方高、中、低劑量及肉桂方高劑量視為敏感。

注：1.茯苓甘草湯水煎液組；2.生姜水煎液；3.茯苓甘草湯等量替換的肉桂組；4.茯苓水煎液

圖2 藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法

注：均為茯苓甘草湯含藥血清：1.高劑量組；2.中劑量組；3.低劑量組

組別藥物濃度(g生藥·mL -1)抑菌圈直徑(mm)茯苓1.0g·mL-10甘草1.0g·mL-113.03±0.85桂枝1.0g·mL -19.41±0.33生姜1.0g·mL -111.99±1.64肉桂1.0g·mL -19.12±0.48茯苓甘草湯原方1.0g·mL-111.84±0.85茯苓甘草肉桂方1.0g·mL-112.09±0.97

組別藥物濃度(g生藥·mL-1)抑菌圈直徑(mm)茯苓1.0g·mL-10甘草1.0g·mL-111.74±0.56桂枝1.0g·mL-19.21±0.42生姜1.0g·mL-112.90±0.29肉桂1.0g·mL-19.43±0.31茯苓甘草湯原方1.0g·mL-112.12±0.33茯苓甘草肉桂方1.0g·mL-111.56±0.19

中藥名藥物濃度(g生藥mL-1)抑菌圈直徑(mm)茯苓甘草湯原方5.0 (高劑量組)13.37±0.432.5(中劑量組)12.65±0.651.25(低劑量組)12.79±0.67苓甘草湯肉桂方5.0(高劑量組)12.46±0.662.5(中劑量組)9.70±1.241.25(低劑量組)9.41±0.76

4 討論

我國是世界上人口最多的國家，Hp感染人口也最多，特別是飲食衛(wèi)生環(huán)境差、經(jīng)濟(jì)較落后的地區(qū)感染率更高，貴州地區(qū)的平均感染率高于全國平均水平[8]。當(dāng)前治療Hp主流是依賴抗生素，取得了一定的療效，但近年來發(fā)現(xiàn)抗生素耐藥、副作用發(fā)生、療效欠穩(wěn)定的問題，使得Hp根除率受到了嚴(yán)重的影響，Hp根除的新路徑是今后研究的方向，對Hp根除使用中醫(yī)藥治療方法是一種新的選擇。

中醫(yī)沒有關(guān)于Hp感染相關(guān)的病名，主要是通過整體觀念來認(rèn)識疾病的發(fā)生、了解疾病的發(fā)展，進(jìn)而對疾病進(jìn)行預(yù)防和治療。大多數(shù)中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為脾胃虛弱是Hp感染致病之本[9]，脾胃虛弱，運化無力而痰飲內(nèi)生，體內(nèi)脾胃陽氣虧虛，失于溫運則水濕停聚于體內(nèi)。形成的痰飲水濕反作用為Hp在體內(nèi)的附著、繁殖和致病提供條件。脾胃虛弱為Hp定植在胃黏膜上提供前提條件[10]，形成的水飲停聚于體內(nèi)的現(xiàn)象又為Hp在胃黏膜的繁殖提供有利條件[11]，這一病變機理與中醫(yī)的胃虛飲停證不謀而和，運用中醫(yī)思維來治療疾病，以扶正祛邪為基本治療原則，代表方為茯苓甘草湯。茯苓淡滲利水，桂枝通陽化氣，生姜溫胃陽辛散水氣，甘草健脾和中，調(diào)和諸藥，四藥共奏溫胃化飲、通陽利水之功效來治療Hp感染引起的疾病。

茯苓甘草湯中茯苓、生姜、甘草均屬藥食同源之物，安全性高。組方中的桂枝與藥食同源的肉桂來自同一樟科植物的一部分[12]，為了使藥物組方更安全，實驗結(jié)果被推廣應(yīng)用，以及能夠在日常生活中自行食用預(yù)防性用藥的角度考慮，在開展茯苓甘草湯對Hp的研究時，增加一組將全方中桂枝同等量換為肉桂的茯苓甘草肉桂湯方進(jìn)行實驗比照。

本次實驗中發(fā)現(xiàn)茯苓經(jīng)過多次抑菌圈測定都無抑菌作用，早期文獻(xiàn)中也有報道[13]，但近期有研究報道茯苓水提物對Hp有一定抑菌作用[14]，與本次實驗有差異，考慮藥物提取存在差異，有抑菌作用的茯苓實驗中茯苓多糖的抑菌作用較茯苓水煎液差，說明茯苓抑制Hp的主要成分不是多糖成分，實驗用80 ℃回流提取，而本次實驗是通過煎煮的方法，溫度遠(yuǎn)超過80 ℃，考慮有效成分可能被破壞。中藥體外抑菌是中醫(yī)抗Hp研究的基礎(chǔ)，為了真實有效對比抑菌情況，需要對中藥材的生產(chǎn)進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)控，中藥的煎煮問題、藥敏實驗方法等都需建立起規(guī)范公認(rèn)的方法。

本文根據(jù)當(dāng)?shù)貫镠p高發(fā)地區(qū)，地處寒濕氣候，當(dāng)?shù)鼐用裣彩撤矢屎裎丁⑿晾?、酒食的飲食?xí)慣，故痰濕體質(zhì)多見，從中醫(yī)角度認(rèn)為Hp致病與胃虛水飲發(fā)病機制類似，治療時從“溫藥和之”治療思想考慮，故用茯苓甘草湯溫胃陽化水飲治Hp，通過體外研究得到一定的驗證，體內(nèi)治療Hp及茯苓甘草湯等質(zhì)量替換肉桂的預(yù)防性實驗，有待進(jìn)一步研究。