傅 奇, 林俊杰, 甘美裕, 盧源欽, 肖玉娟

16S與基因聯(lián)合建樹(shù)快速鑒定海水中的一株地衣芽胞桿菌

傅 奇, 林俊杰, 甘美裕, 盧源欽, 肖玉娟

(廈門(mén)華廈學(xué)院 環(huán)境與公共健康學(xué)院, 福建 廈門(mén) 361024)

在保守序列高度相似的細(xì)菌鑒定中, 單獨(dú)使用16S rDNA/RNA序列進(jìn)行比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)通常無(wú)法準(zhǔn)確鑒定到種, 需要增加測(cè)序基因數(shù)并對(duì)多基因進(jìn)行分析。為實(shí)現(xiàn)快速鑒定, 課題組對(duì)16S與基因聯(lián)合建樹(shù)的方法進(jìn)行了研究, 將海洋來(lái)源的一株桿菌, 分別用通用引物擴(kuò)增16S和基因并測(cè)序, 在GeneBank進(jìn)行序列比對(duì)后, 選擇各菌種保藏中心16S和基因均相似的菌株, 取16S和基因序列, 采用Paup* 4.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。使用16S與拼接序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中屬于同一種的菌株均很好的聚合在一枝, 種間分枝自展值均高于98, 分類(lèi)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確, 篩選得到的桿菌與地衣芽胞桿菌()聚合在一枝, 自展值為100, 鑒定為地衣芽胞桿菌。經(jīng)生理生化試驗(yàn)驗(yàn)證, 該菌株與地衣芽胞桿菌特征完全一致, 使用16S和基因聯(lián)合建樹(shù)得到的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確且快速簡(jiǎn)便。

16S;; 進(jìn)化樹(shù); 地衣芽胞桿菌 ()

芽胞桿菌()是一個(gè)重要的微生物類(lèi)群, 包括枯草芽胞桿菌()、地衣芽胞桿菌()、凝結(jié)芽胞桿菌()、炭疽芽胞桿菌()、蠟樣芽胞桿菌()等與發(fā)酵工業(yè)和生活密切相關(guān)的多個(gè)菌種[1]。其中地衣芽胞桿菌由于生物安全性好、產(chǎn)生多種功能性代謝產(chǎn)物, 在藥品[2]、功能食品[3]、飼料[4]和發(fā)酵工業(yè)[5-7]得到廣泛應(yīng)用, 其中海洋來(lái)源的地衣芽胞桿菌在海水污染處理、新型生物活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)方面具有重要潛力[8, 9]。但在地衣芽胞桿菌的篩選過(guò)程中, 由于芽胞桿菌類(lèi)群保守序列的高度相似性, 無(wú)法單獨(dú)依靠常用的16S rDNA/RNA測(cè)序來(lái)準(zhǔn)確定位到種, 通常需要結(jié)合生理生化鑒定[10, 11]或者其他序列, 如5'端16S-23S ITS核苷酸序列[12]、基因[13]、A[14]甚至全基因序列[15, 16]進(jìn)行分析。基因編碼DNA促旋酶的B亞單位, 在細(xì)菌中廣泛存在, 序列相對(duì)保守, 但進(jìn)化速度快于16S, 目前在細(xì)菌鑒定中的使用逐漸增加[17], 積累了較為豐富的比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù), 但單獨(dú)使用時(shí)部分芽胞桿菌也難以準(zhǔn)確定位, 而16S與序列分別比對(duì)建樹(shù)的方法容易出現(xiàn)進(jìn)化樹(shù)結(jié)構(gòu)沖突, 干擾定位的情況。利用16S與基因聯(lián)合建樹(shù), 以較少的序列數(shù)和進(jìn)化樹(shù)數(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)篩選菌株快速鑒定的方法, 可提高數(shù)據(jù)的利用率, 減少數(shù)據(jù)沖突, 為芽胞桿菌種群的分子生物學(xué)鑒定方法開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本

分離菌株樣本為海泥, 采集于廈門(mén)市集美區(qū)紅樹(shù)林區(qū)。

1.2 材料與試劑

2216E(液體)、2216E瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、V-P試劑盒、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、色氨酸肉湯、克氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基、苯丙氨酸脫羧酶培養(yǎng)基、明膠生化管、硝酸鹽還原試劑盒、Kovacs氏靛基質(zhì)試劑盒等培養(yǎng)基與鑒定試劑均由青島海博生物科技有限公司生產(chǎn); 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR試劑由生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn); 16S通用引物27F/1492R、擴(kuò)增引物UP-1/UP-2r、測(cè)序引物UP-1S/UP-2Sr[18]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 儀器與設(shè)備

PCR儀: 新加坡ESCO公司; 核酸電泳儀: 美國(guó)GE公司; 搖床: 上海蘇坤公司; 生化培養(yǎng)箱: 上海一恒公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理方法

取海泥25 g加入225 mL 2216E液體培養(yǎng)基均質(zhì)后稀釋涂布2216E瓊脂平板, 30℃培養(yǎng)48 h, 取單菌落進(jìn)行純化。

1.4.2 16S與序列提取

用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒, 提取菌株的總DNA; 分別用16S與擴(kuò)增引物擴(kuò)增, 所得PCR產(chǎn)物電泳純化后, 送由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

16S擴(kuò)增條件: 94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性30 s, 65℃退火40 s, 72℃延伸90 s, 共35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。

擴(kuò)增條件[18]: 94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性1 min, 60℃退火1 min, 72℃延伸2 min, 共35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。

1.4.3 16S與序列比對(duì)與進(jìn)化分析

將測(cè)序結(jié)果在Genbank進(jìn)行比對(duì)。為保障數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性, 取相似度較高的1 000個(gè)序列中的各菌種保藏中心菌株進(jìn)行比對(duì), 包括ATCC、NCTC、BCRC、DSM 4個(gè)菌種保藏中心菌株。下載相似菌株的16S與序列, 分別用BioEdit[19]和Clustal X[20]進(jìn)行比對(duì)和編輯, 取有效區(qū)間, 分別使用16S、和16S與線形拼接序列建樹(shù)[21], 采用最大簡(jiǎn)約算法, 用Paup* 4.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[22, 23], 選擇大腸桿菌ATCC 25922[24]作為外群。

1.4.4 生理生化驗(yàn)證

參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[1]和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《飼料微生物添加劑地衣芽孢桿菌》[25]進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化

從海泥中篩選得到一株革蘭氏陽(yáng)性桿菌, 產(chǎn)芽胞, 菌落濕潤(rùn), 呈白色, 編號(hào)為HX2019004。

2.2 16S與gyrB基因測(cè)序

測(cè)序所得16S與序列拼接后有效區(qū)域分別為1 430 bp和1 115 bp。

2.3 序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

16S序列比對(duì)結(jié)果中, 高相似度菌株過(guò)多, 且多數(shù)菌株無(wú)法獲得更多的遺傳標(biāo)記序列; 而序列比對(duì)結(jié)果中, 多數(shù)菌株同時(shí)可獲取16S序列, 因此, 以相似菌株作為建樹(shù)群, 下載16S與基因序列(表1), 比較分別使用16S、和16S與線形拼接序列建樹(shù)結(jié)果。

16S比對(duì)后去除頭尾不整齊片段, 保留中心區(qū)域1 440 bp(含gap);比對(duì)后去除頭尾不整齊片段,保留中心區(qū)域1 056 bp(含gap)。構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)如圖1所示, A樹(shù)基于16S序列構(gòu)建, B樹(shù)基于序列構(gòu)建, C樹(shù)基于16S與拼接序列構(gòu)建, 計(jì)算次數(shù)為1 000, 參數(shù)如表2所示。

表1 GenBank中擁有相似16S與gyrB序列的菌株

續(xù)表

圖1 基于16S與gyrB序列的進(jìn)化樹(shù)(A基于16S序列, B基于gyrB序列, C基于16S與gyrB拼接序列)

表2 基于16S與gyrB序列的進(jìn)化樹(shù)參數(shù)表

從圖1中可以看出, 僅使用16S序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)A分枝自展值低, 無(wú)法準(zhǔn)確定位HX2019004菌株與、、的進(jìn)化關(guān)系; 僅使用序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)B整體分枝自展值較高, 但一致性指數(shù)(CI)較低, 且HX2019004菌株與的分類(lèi)關(guān)系存在疑義, 與A樹(shù)存在較大的結(jié)構(gòu)沖突; 使用16S與拼接序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)C中, 同一類(lèi)菌種均很好的聚合在一枝, 種間分枝自展值均高于98, 表明分類(lèi)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確, HX2019004菌株與地衣芽胞桿菌聚合在一枝, 自展值為100, 表明該菌株為地衣芽胞桿菌可能性高。

2.4 生理生化驗(yàn)證

菌株HX2019004可液化明膠、水解淀粉、還原硝酸鹽, 可利用檸檬酸鹽做為碳源, 可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇產(chǎn)酸, 可分解酪素, 可使牛奶胨化, 可在pH 5.5~8.7范圍內(nèi)、0.001%溶菌酶、7%NaCl、厭氧瓊脂中生長(zhǎng), V-P反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)陽(yáng)性; 不能使苯丙氨酸脫氨, 不能使牛奶凝固, 不能分解酪氨酸, 卵黃反應(yīng)和吲哚反應(yīng)呈陰性。試驗(yàn)結(jié)果與地衣芽胞桿菌生理生化特征吻合[25], 與進(jìn)化分析結(jié)果一致, 命名為HX2019004。

3 結(jié)論

利用16S與基因聯(lián)合建樹(shù)的方法, 課題組快速將一株從海水中篩選得到的芽胞桿菌HX2019004準(zhǔn)確鑒定為地衣芽胞桿菌, 表明該方法在保守序列高度相似菌種間的分類(lèi)鑒定中具有深入研究的價(jià)值。與常用的增加測(cè)序基因數(shù)的方法相比, 該方法測(cè)序量小, 時(shí)間短, 數(shù)據(jù)利用率高; 與多基因分別建樹(shù)的方法相比, 可避免進(jìn)化樹(shù)結(jié)構(gòu)之間的沖突和數(shù)據(jù)紊亂, 提高了進(jìn)化樹(shù)準(zhǔn)確性。課題組下一步將繼續(xù)研究該方法在其他菌群鑒別中的有效性。

[1] Claus D. The genus[M]. New York: Springer, 1986, 2: 1105-1139.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015: 46-47. Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China[M]. Beijing: China Medical Science and Technology Press, 2015: 46-47.

[3] 方明霞, 齊蕾, 王長(zhǎng)泰, 等. 早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)聯(lián)合微生態(tài)制劑對(duì)慢加急性肝功能衰竭病人營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和預(yù)后的影響[J]. 腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng), 2016, 5: 279-282. Fang Mingxia, Qi Lei, Wang Changtai, et al. Efficacy of early application of enteral nutrition combined with microecologics in treatment of acute-on-chronic hepatitis B liver failure[J]. Parenteral & Enteral Nutrition, 2016, 5: 279-282.

[4] 張紅艷, 岳淑寧, 張強(qiáng), 等. 地衣芽胞桿菌在飼料工業(yè)中的應(yīng)用及研究[J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2017, 38(6): 26-28.Zhang Hongyan, Yue Shuning, Zhang Qiang, et al. Application and research ofin feed industry[J]. Animal Husbandry and Feed Science, 2017, 38(6): 26-28.

[5] Saito N. A thermophilic extracellular α-amylase from[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1973, 155(2): 290-298.

[6] 王曉丹, 雷安亮, 王婧, 等. 產(chǎn)四甲基吡嗪地衣芽孢桿菌的應(yīng)用[J]. 中國(guó)釀造, 2017, 36(2): 35-38. Wang Xiaodan, Lei Anliang, Wang Jing, et al. Application ofwith tetramethyl pyrazine yield[J]. China Brewing, 2017, 36(2): 35-38.

[7] 樂(lè)超銀, 邵偉, 劉海軍, 等. 一株地衣芽孢桿菌的分離及在大豆肽發(fā)酵中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)釀造, 2008, 12: 41-44. Yue Chaoyin, Shao Wei, Liu Haijun, et al. Isolation and classification of astrain and its application in soybean peptide fermentation[J]. China Brewing, 2008, 12: 41-44.

[8] 楊波, 司曉光, 郝建安, 等. 海洋地衣芽孢桿菌的絮凝活性研究及機(jī)理探討[J]. 化學(xué)與生物工程, 2017, 10: 45-48. Yang Bo, Si Xiaoguang, Hao Jianan, et al. Flocculation activity and mechanism of marine[J]. Chemistry & Bioengineering, 2017, 10: 45-48.

[9] 彭亞林. 印度洋深海熱液區(qū)鹽單胞菌和地衣芽胞桿菌的篩選、鑒定及生理生化特性研究[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2008. Peng Yalin. Isolation, identification and biochemical characterization ofandfrom deep-sea hydrothermal vent in Indian Ocean[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2008.

[10] Logan N A, Berkeley R C W. Identification ofstrains using the API system[J]. Microbiology, 1984, 130(7): 1871-1882.

[11] O’donnell A G, Norris J R, Berkeley R C W, et al. Characterization of,,, andby pyrolysis gas-liquid chromatography, deoxyribonucleic acid-deoxyribonucleic acid hybridization, biochemical tests, and API systems[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1980, 30(2): 448-459.

[12] Xu D, Cote J C. Phylogenetic relationships betweenspecies and related genera inferred from comparison of 3′ end 16S rDNA and 5′ end 16S–23S ITS nucleotide sequences[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2003, 53(3): 695-704.

[13] Wang L T, Lee F L, Tai C J, et al. Comparison ofgene sequences, 16S rRNA gene sequences and DNA- DNA hybridization in thegroup[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 1846-1850.

[14] 喻國(guó)輝, 牛春艷, 陳遠(yuǎn)鳳, 等. 利用16S rDNA結(jié)合gyrA和基因?qū)ι姥挎邨U菌R31的快速鑒定[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào), 2010, 26(2): 160-166. Yu Guohui, Niu Chunyan, Chen Yuanfeng, et al. Use of 16S rDNA,andgene sequence to identify a biocontrolsp. strain R31[J]. Chinese Journal of Biological Control, 2010, 26(2): 160-166.

[15] Lapidus A, Galleron N, Andersen J T, et al. Co-linear scaffold of theandgenomes and its use to compare their competence genes[J]. FEMS Microbiology Letters, 2002, 209(1): 23-30.

[16] Rey M W, Ramaiya P, Nelson B A, et al. Complete genome sequence of the industrial bacteriumand comparisons with closely relatedspecies[J]. Genome Biology, 2004, 5(10): 77.

[17] Watanabe K, Nelson J, Harayama S, et al. ICB database: thedatabase for identification and classification of bacteria[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29(1): 344-345.

[18] Yamamoto S, Harayama S. PCR amplification and direct sequencing ofgenes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis ofstrains[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(3): 1104-1109.

[19] Hall T A. Bioedit: a user—friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT[J]. Nucleic Acids Symposium Series, 1999, 41: 95-98.

[20] Thomson J D, Gibson T J, Plewniak F, et al. The clustal_X windows interface: Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research, 1997; 25: 4876-4882.

[21] Zhao C L, Cui B K, Dai Y C. New species and phylogeny ofbased on morphological and molecular characters[J]. Fungal Diversity, 2013; 58(1): 47-60.

[22] Jiang X Z, Yu H Y, Xiang M C, et al.variabile, a new genus and species offrom soil nematodes[J]. Fungal Diversity, 2011, 46: 43-51.

[23] 肖玉娟, 傅奇, 沈金海, 等. 一株引起廈門(mén)地區(qū)不同作物感染的分離與鑒定[J]. 科學(xué)技術(shù)與工程, 2018, 18(14): 20-23. Xiao Yujuan, Fu Qi, Shen Jinhai, et al. Isolation and identification of astrain which infected different crops in Xiamen area[J]. Science Tech-nology and Engineering, 2018, 18(14): 20-23.

[24] Minogue T D, Daligault H A, Davenport K W, et al. Complete genome assembly ofATCC 25922, a serotype O6 reference strain[J]. Genome Announcements, 2014, 2(5): e00969-14.

[25] 全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). NY/T 1461-2007 飼料微生物添加劑地衣芽孢桿菌[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2007: 2-3.National Feed Industry Standardization Technical Committee. NY/T 1461-2007. Microorganism feed additives[S]. Beijing: Standards Press of China, 2007: 2-3.

[26] Satomi M, La Duc M T, Venkateswaran K. Bacillus safensis sp. nov., isolated from spacecraft and assembly-facility surfaces[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2006, 56(8): 1735-1740.

[27] Hsieh F C, Li M C, Lin T C, et al. Rapid detection and characterization of surfactin-producing Bacillus subtilis and closely related species based on PCR[J]. Current Microbiology, 2004, 49(3): 186-191.

[28] Rachinger M, Volland S, Meinhardt F, et al. First insights into the completely annotated genome sequence of Bacillus licheniformis strain 9945A[J]. Genome Announcements, 2013, 1(4): e00525-13.

Identification of astrain from seawater using a phylogenetic tree based on 16S andgene sequences

FU Qi, LIN Jun-jie, GAN Mei-yu, LU Yuan-qin, XIAO Yu-juan

(College of Environment and Public Health, Xiamen Huaxia University, Xiamen 361024, China)

For identifying bacteria with highly similar conserved sequences, 16S rDNA does not provide adequate resolution for comparative sequence analysis; therefore, more DNA sequences and analysis models are required for classification. To develop a rapid identification method, phylogenetic trees based on 16S andgene sequences were investigated. A strain of bacillus was isolated from seawater, and the 16S andgenes of the strain were amplified with universal primers and sequenced. Using BLAST in GenBank, other strains with similar 16S andgenes were selected. Phylogenetic trees based on 16S andgenes were constructed using PAUP* 4.0. In the tree constructed using sequences of both 16S andgenes, strains belonging to the same species were clustered together, the self-expanding values of the branches were higher than 98, and the classification structure was accurate. The isolated strain polymerized within the phylogenetic tree, and the self-expanding value was 100. Physiological and biochemical tests verified that the strain belongs to the species. Thus, the identification of this strain ofobtained by construction of a phylogenetic tree based on the combination of 16S andgenes was accurate, rapid, and simple.

16S;; phylogenetic tree;

Oct. 18, 2019

[Fujian Education and Scientific Research Project for Young and Middle-aged Teachers, No. JAT170821; The Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Program of Fujian Province, No. 201812709001; Teaching Reform Research Project of Fujian Province, No. FBJG20180124]

Q939

A

1000-3096(2020)04-0090-06

10.11759/hykx20191018002

2019-10-18;

2019-11-08

福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目(科技類(lèi))(JAT170821); 福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201812709001); 福建省本科高校教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目(FBJG20180124)

傅奇(1986-), 男, 湖南湘潭人, 講師, 碩士, 主要從事微生物資源開(kāi)發(fā), 電話: 0592-6276262, E-mail: fq@hxxy.edu.cn; 肖玉娟,

, 電話: 0592-6276260, E-mail: xyj@hxxy.edu.cn

(本文編輯: 譚雪靜)