邢德君 孫慶霞 (吉林省腫瘤醫(yī)院內三科,吉林 長春 30000;吉林省前衛(wèi)醫(yī)院檢驗科)
受大氣污染、環(huán)境致癌物及吸煙人群等因素的影響,肺癌的發(fā)病率逐年增加,其發(fā)病率及病死率均居于各類腫瘤的前列,危害巨大〔1〕。肺癌晚期患者的治療主要為化療、放療及靶向治療,其中化療選擇性較差,對人體正常細胞也有較大的影響,易產(chǎn)生惡心嘔吐、骨髓抑制、肝腎功能損害等諸多反應;放療也會導致放射性肺炎、放射性脊髓病、放射性食管炎、放射性心包炎等危害;而靶向治療目前只有少數(shù)受體陽性的肺癌患者才能采用,其療效也有待于進一步評估〔2〕。因此,尋找對肺癌敏感的藥物是醫(yī)務人員及科研工作者始終關注的焦點問題。
秦皮乙素是從檸檬葉、苦櫪白蠟樹樹皮、地黃、曼陀羅、顛茄等植物中提取的單體成分,又稱6,7-二羥基香豆素,為香豆素的衍生物。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),秦皮乙素具有治療糖尿病、腸道疾病、保肝、化痰平喘、抗氧化、抗菌及抗炎等多種活性〔3〕。近年來,秦皮乙素在腫瘤治療中的應用得到廣泛重視,其對白血病、骨髓瘤、腦膠質瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、腸癌、胰腺癌、肝癌及胃癌等均有治療作用〔4〕。秦皮乙素對人肺癌H460細胞也有一定的抑制作用,但相關研究僅局限于體外實驗,且作用機制并未闡明〔5〕。本研究選擇Lewis肺癌小鼠模型,在秦皮乙素抗肺癌作用的基礎上,探討其與凋亡及Wnt/β-catenin通路的相關性,旨在為臨床肺癌的治療尋找新的低毒、高效的化療藥物。
1.1細胞與動物 小鼠Lewis肺癌細胞,購于美國ATCC公司,培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清)。雄性C57BL/6小鼠,6~8周齡,SPF級,購于吉林大學實驗動物中心,生產(chǎn)許可證號:SCXK(吉)2016-0001;自由飲水,常規(guī)飼養(yǎng)。
1.2藥品與試劑 秦皮乙素〔高效液相色譜法(HPLC)>90%〕,南京道斯夫生物公司,批號:20180225;順鉑注射液,南京制藥公司,批號:20171109;胎牛血清及DMEM培養(yǎng)液,美國Gibco公司;Annexin-V-異硫氨酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒,美國BD公司;逆轉錄試劑盒,上海生科公司;實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒,美國BD公司;caspase3、8和9活性測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;β-catenin,Cyclin D1、c-Myc抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗,上海碧云天公司。
1.3主要儀器設備 分析天平(FA2004B),上海精科公司;CO2培養(yǎng)箱(BPN-150RHP),上海一恒儀器公司;倒置顯微鏡(IX53),日本奧林巴斯公司;流式細胞儀(FACSCanto Ⅱ),美國BD公司;實時熒光定量PCR儀(StepOne TM),美國ABI公司;紫外/可見分光光度計(6010),上海惠普儀器公司。
1.4建立小鼠Lewis肺癌模型 將凍存的Lewis肺癌細胞復蘇并培養(yǎng)至對數(shù)生長期,在C57BL/6小鼠背側皮下接種(0.2 ml),2 w后,脫頸處死小鼠。常規(guī)消毒,將腫瘤組織剝離,于無菌平皿中剪碎,在組織研磨器中研磨;加入適量4℃生理鹽水,調整Lewis肺癌細胞液濃度為1×107/L。小鼠右腋皮下注射將上述細胞液0.2 ml以建立小鼠Lewis肺癌模型。
1.5分組及給藥 隨機分為模型組、順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組各12只。順鉑組(1 mg/kg)腹腔注射給藥,秦皮乙素高劑量組(100 mg/kg)及秦皮乙素低劑量組(50 mg/kg)灌胃給藥,模型組灌胃等體積溶媒;造模后第2天開始給藥,1次/d,共14 d。
1.6瘤質量及抑瘤率測定 在末次給藥的次日,處死小鼠,無菌條件下將腫瘤組織剝離。用預冷的生理鹽水沖洗,并經(jīng)濾紙拭干后,稱量瘤質量;按照公式計算抑瘤率。抑瘤率=(1-藥物組瘤質量/模型組瘤質量)×100%。
1.7凋亡率測定 常規(guī)方法制備瘤組織單細胞懸液,并用磷酸鹽緩沖液調整細胞密度為1×106個/ml,取100 μl細胞懸液至于1.5 ml離心管中。向離心管中再加入PI和Annexin-V-FITC溶液各5 μl,避光4℃條件下放置30 min,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
1.8Bax及Bcl-2 mRNA表達測定 取剪碎后的瘤塊組織,Trizol法提取瘤塊組織總RNA,逆轉錄法合成cDNA,引物序列信息如表1所示,由大連寶生物工程有限公司合成。采用實時定量PCR法測定Bax及Bcl-2 mRNA表達水平。擴增條件為:96℃,預變性5 min;96℃變性30 s,62℃退火30 s,70℃延伸30 s,共計35個循環(huán)。以β-actin為內參基因,采用2-△△Ct法對所得數(shù)據(jù)進行定量分析。
表1 引物序列信息
1.9caspase3、8和9活性測定 取剪碎后的瘤塊組織,在冰上加入預冷的裂解緩沖液,制備10%勻漿液。離心(10 000 r/min,5 min),收集上清液,備用。利用紫外/可見分光光度計,按照試劑盒說明書中的操作步驟,檢測瘤組織caspase3、8和9活性。
1.10Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達測定 取1.9中的10%瘤組織勻漿上清液,采用Western印跡法測定秦皮乙素對荷瘤小鼠瘤組織β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達的影響。二喹啉酸法測定上清液總蛋白濃度后,按比例將上清液與上樣緩沖液混合,加熱煮沸10 min進行變性。加入20 μl蛋白樣品于加樣孔中,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。依次進行轉膜、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、顯色及曝光等操作后;通過與內參蛋白β-actin比較,分析目的蛋白的相對表達水平。
1.11統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。
2.1秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠瘤質量及抑瘤率的影響 與模型組比較,順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組瘤質量均顯著降低(均P<0.05);與順鉑組比較,秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組瘤質量均顯著增加(均P<0.05)。見表2。
表2 各組瘤質量及抑瘤率
與模型組比較:1)P<0.05;與順鉑組比較:2)P<0.05;下表同
2.2秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞凋亡率的影響 與模型組〔(8.75±1.23)%〕比較,順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組腫瘤細胞凋亡率〔(42.14±6.31)%、(33.46±5.80)%、(20.82±3.79)%〕顯著增加(P<0.05);與順鉑組比較,秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組腫瘤細胞凋亡率均顯著降低(P<0.05),且秦皮乙素高劑量組誘導凋亡效果優(yōu)于秦皮乙素低劑量組。見圖1。
2.3秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織Bax及Bcl-2 mRNA表達的影響 與模型組比較,順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組腫瘤組織Bax mRNA表達顯著增加,而Bcl-2 mRNA表達顯著降低(均P<0.05);與順鉑組比較,秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組腫瘤組織Bax mRNA表達顯著降低,而Bcl-2 mRNA表達顯著增加(均P<0.05)。見表3。
2.4秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織caspase3、8和9活性的影響 與模型組比較,順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組caspase3、8和9活性均顯著增加(均P<0.05);與順鉑組比較,秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組caspase3、8和9活性均顯著降低(均P<0.05)。見表3。
2.5秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的影響 與模型組比較,順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達被明顯抑制,表達量均顯著降低(均P<0.05);與順鉑組比較,秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達均顯著增加(均P<0.05)。見表4和圖2。
圖1 秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞凋亡率的影響
組別BaxBcl-2caspase3(U/mg)caspase8(U/mg)caspase9(U/mg)模型組0.41±0.050.74±0.090.54±0.070.45±0.050.24±0.02順鉑組1.13±0.201)0.23±0.031)1.87±0.221)0.98±0.131)0.62±0.071)秦皮乙素高劑量組0.97±0.141)2)0.32±0.041)2)1.69±0.151)2)0.77±0.081)2)0.56±0.061)2)秦皮乙素低劑量組0.86±0.111)2)0.59±0.081)2)1.31±0.211)2)0.62±0.091)2)0.45±0.041)2)
表4 各組腫瘤組織Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達
圖2 Western印跡檢測秦皮乙素各組腫瘤組織Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達
腫瘤細胞凋亡過程受阻是腫瘤發(fā)生的重要因素〔6〕。本研究提示秦皮乙素抑制Lewis肺癌小鼠的腫瘤生長與誘導凋亡作用有關。Bcl-2基因家族在線粒體通路調控細胞凋亡進程中有關鍵性重要作用,其中Bax和Bcl-2是功能截然相反的兩個基因,Bax可促進細胞發(fā)生凋亡,而Bcl-2主要抑制細胞凋亡進程,二者共同調控線粒體功能介導的細胞凋亡〔7〕。本研究證明秦皮乙素可誘導Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞發(fā)生凋亡。秦皮乙素還可抑制肺瘤小鼠腫瘤組織caspase3、8和9的活性。caspase3的活化標志著凋亡進入不可逆階段,是細胞凋亡的主要效應分子,為caspase家族中最為重要的凋亡執(zhí)行者〔8〕。caspase8具有活化下游caspase3、6和7的作用,而caspase9可以與凋亡相關因子1結合聚合形成凋亡小體,進而誘導細胞發(fā)生凋亡〔9〕。本研究結果表明,秦皮乙素抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤生長的作用與誘導凋亡有關。Wnt信號通路包括Wnt/β-catenin信號通路、平面細胞極性信號通路及Wnt/Ca2+信號通路,其中經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路參與調控腫瘤細胞的凋亡、周期及增殖等過程〔10〕。研究表明〔11〕,Wnt/β-catenin信號通路的異?;罨c肺癌、前列腺癌、膀胱癌、結腸癌等相關,其中Wnt信號通路中最關鍵的轉導因子β-catenin,參與調控細胞凋亡、分化、生長及黏附等過程。β-catenin活化后,下游Cyclin D1、c-Myc等效應分子表達增加,導致腫瘤發(fā)生〔12〕。另有研究表明〔13〕,肺癌與Wnt/β-catenin信號通路關系密切,可影響肺癌的惡性程度,決定著患者生存與預后情況。因而,Wnt/β-catenin信號通路可作為肺癌治療的靶點,抑制該通路的激活,可起到抗肺癌作用〔14〕。本研究表明秦皮乙素具有抑制Wnt/β-catenin通路活化的作用。綜上,秦皮乙素可通過誘導凋亡及抑制Wnt/β-catenin通路激活,發(fā)揮抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤生長的作用,但具體機制還有待于深入研究。