孫云朝 郭娜 李德輝 葛建立 馬云龍 張欣 蘇坤 (河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

肢體動脈硬化閉塞癥(ASO)是外科臨床常見病，發(fā)病率隨年齡增長而逐漸升高，患者早期出現(xiàn)間歇性跛行等下肢缺血的臨床表現(xiàn)，病情進(jìn)一步發(fā)展可出現(xiàn)下肢營養(yǎng)障礙，表現(xiàn)為靜息痛，直至肢端發(fā)生壞死而截肢，降低了患者生活質(zhì)量。目前ASO治療有藥物治療、血管介入、手術(shù)治療等，但外科手術(shù)移植物長期通暢率低，血管介入遠(yuǎn)期療效并不肯定，尚缺乏確切理想的治療方法。中醫(yī)治療從病因病機(jī)到診斷治療均有記載，雖療效尚可，但多不穩(wěn)定，每易復(fù)發(fā)，且大多僅為臨床經(jīng)驗的總結(jié)，尚缺乏系統(tǒng)的科學(xué)論證。課題組前期對ASO做了大量臨床研究，應(yīng)用芪黃疽愈方治療ASO取得滿意療效，并且成功制作了大鼠模型，從實驗角度再次證實芪黃疽愈方的治療作用〔1～3〕，但其生物學(xué)機(jī)制仍待進(jìn)一步明確。芪黃疽愈方治療ASO可能與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子有關(guān)。本研究旨在探討芪黃疽愈方對ASO大鼠炎癥細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠50只(4～6周齡)，體重(200±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2飼料制備〔4〕高脂飼料，配比為83.5%基礎(chǔ)飼料，5%豬油，1%膽固醇，0.5%膽酸鈉及10%蛋黃粉。

1.3藥物及試劑 芪黃疽愈方：黃芪20 g、黃精12 g、紅花12 g、鬼箭羽12 g、土鱉蟲9 g、雞血藤15 g、延胡索12 g、牛膝9 g、海藻12 g，由河北省中醫(yī)院煎藥室煎制，配制成最終濃度分別為0.35 g/ml，0.75 g/ml，1.5 g/ml藥液。實驗過程中每次中藥制劑均按同一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行；維生素D3注射液(江蘇吳中蘇州制藥)；大鼠內(nèi)皮素(ET)-1、白細(xì)胞介素(IL)-1β試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；一氧化氮(NO)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；核因子(NF)-κB p65抗體、腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體均購自Abcam公司。

1.4實驗分組與造模 50只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、疾病模型組、芪黃疽愈方高濃度組、芪黃疽愈方中濃度組、芪黃疽愈方低濃度組，每組10只，正常對照組普通飲食喂養(yǎng)，自由飲水。疾病模型組與芪黃疽愈方各劑量組高脂飼料喂養(yǎng)1 w，于清潔動物實驗室內(nèi)用1%戊苯巴比妥鈉(1 ml/200 g)腹腔注射麻醉；每只大鼠取左后肢消毒，從腹股溝中點向后肢內(nèi)側(cè)縱行切開皮膚，分離并暴露隱動脈，用動脈夾阻斷隱動脈遠(yuǎn)近端1.5～2.0 cm，取胰島素注射器1支，沿隱動脈血管長軸由遠(yuǎn)端向近端刺入血管腔，將0.2～0.3 ml注射用無菌蒸餾水緩慢注入阻斷部位血管，至血管充盈為止，5 min后取下針頭和動脈夾，壓迫止血，縫合切口，內(nèi)膜損傷模型完成〔4〕。后疾病模型組大鼠予以高脂飼料喂養(yǎng)，并在大鼠右下肢肌肉注射維生素D3針劑(3×105U/kg體重)，每隔30 d重復(fù)1次；造模1 w后，給予生理鹽水(1 ml/100 g)灌胃，每日1次，連續(xù)12 w，自由飲水。芪黃疽愈方各劑量組(高濃度組、中濃度組、低濃度組)大鼠予以高脂飼料喂養(yǎng)，并在大鼠右下肢肌肉注射維生素D3針劑(3×105U/kg體重)，每隔30 d重復(fù)1次；造模1 w后，芪黃疽愈方相應(yīng)濃度中藥灌胃(1 ml/100 g)，每日1次，連續(xù)12 w，自由飲水。

1.5檢測指標(biāo)

1.5.1血清ET-1、NO、IL-1β含量檢測 末次給藥前禁食12 h，給藥1 h后，用1%戊苯巴比妥鈉(1 ml/200 g)腹腔注射麻醉，下腔靜脈采血約8 ml，2 500 r/min離心5 min后，分離出血清，用于ET-1、NO、IL-1β檢測。檢測方法按試劑盒說明書。

1.5.2動脈內(nèi)皮TNF-α、NF-κB蛋白表達(dá)水平檢測 切取大鼠左后肢隱動脈放入1.5 ml的EP管中，加裂解液勻漿，離心后吸取上清，4℃保存?zhèn)溆茫慌渲婆Ｑ灏椎鞍?BSA)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液及二喹啉甲酸(BCA)工作液，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析；將提取的蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜后，一抗與靶蛋白結(jié)合，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合；將聚偏氟乙烯(PVDF)膜平鋪于保鮮膜上，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液避光反應(yīng)2 min。采用Quantity One成像系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行灰度掃描，運用Image Lab分析軟件對各組條帶進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1血清ET-1、NO、IL-1β含量水平變化 與正常對照組比較，疾病模型組血清ET-1、IL-1β含量水平顯著升高，NO水平顯著降低(均P<0.01)。與疾病模型組比較，芪黃疽愈方各劑量組血清ET-1、IL-1β含量水平均顯著下降，NO水平顯著升高(均P<0.01，P<0.05)，見表1。

2.2動脈內(nèi)皮TNF-α、NF-κB蛋白表達(dá)水平檢測 與正常對照組比較，疾病模型組動脈內(nèi)皮TNF-α、NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高(均P<0.01)；與疾病模型組比較，芪黃疽愈方各劑量組動脈內(nèi)皮TNF-α、NF-κB蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01，P<0.05)。見圖1及表2。

表1 各組血清ET-1、IL-1β含量

與空白對照組比較:1)P<0.01；與疾病模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

1:正常對照組;2:疾病模型組;3:芪黃疽愈方低濃度組;4:芪黃疽愈方中濃度組;5:芪黃疽愈方高濃度組圖1 各組TNF-α、NF-κB蛋白表達(dá)

組別TNF-α/β-actinNF-κB/β-actin正常對照組0.53±0.180.65±0.17疾病模型組0.94±0.321) 0.97±0.281)芪黃疽愈方低濃度組0.86±0.302) 0.68±0.212)芪黃疽愈方中濃度組0.77±0.242) 0.59±0.153)芪黃疽愈方高濃度組 0.55±0.213) 0.52±0.133)

3 討 論

ASO是指由于動脈粥樣硬化導(dǎo)致下肢供血動脈內(nèi)膜增厚、管腔狹窄或閉塞，病變肢體血流供應(yīng)不足，從而使肢體出現(xiàn)一系列缺血癥狀的慢性進(jìn)展性疾病，其臨床表現(xiàn)包括下肢間歇性跛行、皮溫降低、疼痛，乃至發(fā)生潰瘍或壞死等〔5〕。ASO的發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要有脂質(zhì)滲透、內(nèi)膜損傷、血栓形成和平滑肌反應(yīng)學(xué)說，但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為內(nèi)膜損傷對ASO的形成作用更為突出〔6〕。當(dāng)血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)受到損傷時，會出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)內(nèi)分泌功能的障礙，VEC分泌的活性物質(zhì)平衡破壞。病理情況下VEC損傷表現(xiàn)為ET-1合成和釋放增加，具有強(qiáng)烈的縮血管和促細(xì)胞增殖作用；而內(nèi)皮保護(hù)因子NO分泌水平降低，從而使血管平滑肌處于持續(xù)收縮狀態(tài)。IL-1又名淋巴細(xì)胞刺激因子，主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。IL-1能夠誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化并分泌IL-1β，使其表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1，介導(dǎo)免疫細(xì)胞和脂質(zhì)浸潤血管壁形成斑塊，在動脈硬化閉塞癥形成過程中發(fā)揮重要作用。TNF-α被認(rèn)為是炎癥的關(guān)鍵因子，可通過抑制VEC 一氧化氮合酶(NOS)活性進(jìn)而減弱NO血管的舒張作用，加速ASO發(fā)生和進(jìn)程，在ASO的形成機(jī)制中也起著關(guān)鍵作用〔7〕。NF-κB的活化是ASO發(fā)生的始動機(jī)制之一，通過調(diào)控炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6等)、炎性酶〔誘導(dǎo)型NOS(iNOS)、環(huán)氧化酶(COX)-2〕、黏附分子〔細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、VCAM-1〕、人單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1等基因表達(dá)，在ASO的進(jìn)程中有著關(guān)鍵性作用。炎癥因子不但能導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，使NF-κB活化，而且隨著NF-κB的活化，釋放更多的炎癥因子，對炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大，進(jìn)而促使ASO形成〔8〕。隨著炎癥的不斷進(jìn)展，激活白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，使之釋放纖維生長因子等生長因子，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞變?yōu)楹铣杀硇?，促使其增殖并進(jìn)入血管內(nèi)膜，促使動脈粥樣硬化形成。

ASO屬祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“脫疽”范疇。初起肢冷麻木，后期趾節(jié)壞死脫落，黑腐潰爛，瘡口經(jīng)久不愈為主要表現(xiàn)。根據(jù)中醫(yī)“營衛(wèi)氣血”、“久病入絡(luò)”、“久病多瘀”、“久病多虛”等理論，脫疽患者年老體衰，素體氣陰不足，氣虛無力推動，氣血津液不能輸布，津凝為痰，血滯為瘀，痰瘀互結(jié)為癥，日久最終導(dǎo)致痰瘀阻絡(luò)，經(jīng)脈不通而發(fā)病?？梢?，脫疽是氣陰兩虛為本，經(jīng)絡(luò)癥積瘀結(jié)為標(biāo)，其病位在血脈，為本虛標(biāo)實之證。因此治療需以益氣養(yǎng)陰、消癥散結(jié)、通經(jīng)活絡(luò)為主，基于此法自擬芪黃疽愈方，應(yīng)用于ASO患者的治療。經(jīng)過大量的臨床觀察，芪黃疽愈方使ASO患者循環(huán)評分、跛行指數(shù)及踝肱比明顯改善，近期療效與西藥組無明顯差異，但遠(yuǎn)期療效明顯高于西藥組。通過動物實驗，初步證實，芪黃疽愈方具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，降低血液黏稠度的作用〔1～3〕。

本研究表明芪黃疽愈方可通過抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮，干預(yù)ASO發(fā)展的進(jìn)程。