趙曉輝 許嘉彬 王秀艷 王立波

(1佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154002；2深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院(深圳市第二人民醫(yī)院)心內(nèi)科)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CAHD)是指冠狀動脈血管發(fā)生粥樣硬化導(dǎo)致管腔內(nèi)出現(xiàn)狹窄甚至閉塞，使得心肌細(xì)胞缺血缺氧甚至壞死而引發(fā)的一種心臟病，簡稱冠心病(CHD)，也稱缺血性心臟病(IHD)〔1〕。研究表明，CHD的發(fā)生與多種危險(xiǎn)因素有關(guān)，包括年齡、性別、吸煙、高血壓、高血脂和糖尿病等。在這些危險(xiǎn)因素的作用下，由多種細(xì)胞及因子相互作用形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)共同參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程，其中脂代謝異常是重要的因素之一〔2〕。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素(PCSK)9是近年來發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)與脂代謝相關(guān)的基因，且不同基因型可以導(dǎo)致低膽固醇血癥或高膽固醇血癥的發(fā)生，這可能是CHD的新致病因素〔3〕。本文研究PCSK9基因多態(tài)性在人群中分布特點(diǎn)及其與脂代謝的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2016年12月至2017年12月因心絞痛和(或)運(yùn)動試驗(yàn)陽性及有冠脈管腔狹窄的證據(jù)而需要入院進(jìn)一步行冠狀動脈造影(CAG)者220例。病例組為經(jīng)CAG確診為CHD的患者共110例，對照組為非CHD患者共110例。病例組與對照組均男69例，女41例。病例組平均年齡(60.12±10.05)歲，對照組(60.03±10.03)歲，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 0.067，P=0.947)，病例組與對照組各個(gè)年齡層分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<50歲：18例 vs 16例；50～59歲：33例 vs 37例；60～69歲：39例 vs 35例；≥70歲：20例 vs 22例；χ2=0.658，P=0.883)。受試對象在接受試驗(yàn)之前均被詳細(xì)告知研究相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)及注意事項(xiàng)并簽署知情同意書。 排除標(biāo)準(zhǔn)：非黑龍江省東部地區(qū)人(非自幼生長于本地區(qū)者)、非漢族人群、腫瘤、炎癥、心肌梗死、心力衰竭、腦梗死或短暫性腦缺血發(fā)作、肝腎疾病和甲狀腺疾病及其外周血管疾病。

1.2流行病學(xué)調(diào)查及樣本收集 收集并整理所有研究對象的年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓和糖尿病等基線資料，均于空腹12 h后用普通生化管抽取外周靜脈血2 ml用于血脂的檢測，并借助全自動生化分析儀進(jìn)行血脂水平的檢測；另外用含乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管抽取研究對象外周靜脈血3 ml用于DNA的粗提取。

1.3PCSK9基因第1外顯子測序及A53V位點(diǎn)多態(tài)性分析 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測。

1.3.1基因組DNA提取 取EDTA采血管中的血液樣本400 μl，按照Solarbio全血基因組DNA提取試劑盒說明書要求提取基因組DNA。

1.3.2PCR擴(kuò)增目的基因片段 使用軟件DNAman設(shè)計(jì)并合成PCSK9基因第1外顯子引物，挑選任意5個(gè)DNA樣本對目的基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，上游引物：5′-TTCCAGCCCAGTTAGGATTTG-3′,下游引物：5′-CCCAAGATCGTGCCAAGCGAAG-3′。PCR體系(25 μl)：上、下游引物各0.5 μl，dNTP混合物(10 mmol/L)0.5 μl，Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.3 μl，ddH2O 17.2 μl，緩沖液A 5.0 μl，目標(biāo)DNA 1.0 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，上述步驟循環(huán)30次，72℃10 min，16℃ 30 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.3基因序列測定 應(yīng)用全自動DNA測序儀進(jìn)行正反向測序，測序結(jié)果使用SnapGene軟件與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中的PCSK9基因序列進(jìn)行比對，確定突變位點(diǎn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)；Hardy-Weinberg遺傳平衡χ2檢驗(yàn)及單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)或TamhaneT2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床資料的比較 病例組吸煙、高血壓、糖尿病人數(shù)均顯著多于對照組(P<0.05)；血清TG、TC和LDL-C水平均顯著高于對照組(P<0.05)，HDL-C顯著低于對照組(P<0.05)；兩組飲酒人數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別吸煙〔n(%)〕飲酒〔n(%)〕高血壓〔n(%)〕糖尿病〔n(%)〕TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)病例組49(44.55)35(31.82)57(51.82)35(31.82)2.47±1.464.82±1.071.28±0.282.78±0.84對照組31(28.18)28(25.45)23(20.91)12(10.91)2.01±1.624.49±1.061.42±0.442.56±0.81t或χ2值6.3641.09022.70714.3132.2112.281-2.8412.055P值0.0120.2960.0000.0000.0280.0240.0050.041

2.2PCSK9基因第1外顯子PCR擴(kuò)增結(jié)果 以DL2000 Marker作為標(biāo)準(zhǔn)帶進(jìn)行比對，各擴(kuò)增條帶與設(shè)計(jì)的引物片段大小相同(圖1)。

1～5均為樣本圖1 PCSK9基因第1外顯子PCR產(chǎn)物凝膠電泳

2.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果 經(jīng)過序列比對共發(fā)現(xiàn)6個(gè)突變位點(diǎn)(表2、圖2)。

表2 PCSK9基因序列突變篩查結(jié)果

“-”目前尚無相關(guān)研究或文獻(xiàn)報(bào)道

圖2 PCSK9第1外顯子突變位點(diǎn)測序峰

2.4兩組PCSK9基因A53V位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的比較 共檢測出CC和TC兩種基因型，未檢測到TT基因型。采用HWE軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg吻合度檢驗(yàn)表明PCSK9基因A53V位點(diǎn)上的等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。PCSK9基因A53V位點(diǎn)以CC基因型為主，而等位基因主要是C。與對照組相比，病例組C基因型頻率較低，而T基因型頻率較高；兩組C等位基因頻率均高于T等位基因頻率。兩組基因型分布和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)。見表3。

2.5組內(nèi)各基因型血脂水平比較 病例組和對照組各基因型間血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平差異顯著(P<0.05)。病例組中TC基因型血清TG、TC和LDL-C水平均顯著高于CC基因型(P<0.05)，而血清HDL-C水平低于CC基因型，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對照組中TC基因型血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平均高于CC基因型，僅血清TC水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組同基因型血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表3 PCSK9基因A53V的等位基因頻率和基因型頻率的比較 (n=110)

表4 兩組不同基因型組間血脂水平比較

與CC相比：1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

CHD病理學(xué)基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(AS)。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，CHD已成為西方發(fā)達(dá)國家人口死亡的主要原因，而近年來我國的CHD患病率也呈現(xiàn)逐年上升的態(tài)勢。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病和血脂異常等因素均為CHD的危險(xiǎn)因素，與CHD的發(fā)病具有密切關(guān)系。此外，近年來發(fā)現(xiàn)遺傳因素在CHD發(fā)病中具有重要的作用，一些血脂相關(guān)基因可能與早發(fā)心血管疾病有關(guān)。CHD發(fā)病率在不同的種族人群，甚至是同一生活條件下同種族不同個(gè)體中也存在差異，提示遺傳因素可能是CHD患病的另一個(gè)重要因素。PCSK9是近幾年來才被發(fā)現(xiàn)的家族性高膽固醇血癥相關(guān)基因，其編碼蛋白具有促進(jìn)肝細(xì)胞表面LDL受體降解的作用，可以抑制LDL-C在體內(nèi)被清除代謝，使得血清LDL-C水平升高，導(dǎo)致AS形成〔4，5〕。另外，PCSK9還可能通過對細(xì)胞膜表面受體CD36的表達(dá)方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而干預(yù)AS發(fā)生、發(fā)展〔6〕。目前基于血脂異常所致AS的作用機(jī)制而研發(fā)的靶向治療藥物PCSK9抑制劑alirocumab(Praluent，Sanofi-Aventis & Regeneron)和evolocumab(Repatha，Amgen Inc)已通過臨床研究并于國外上市，在服用高劑量他汀類藥物仍然無法使血脂達(dá)標(biāo)的患者臨床治療中取得良好的效果〔7〕。并且，與單獨(dú)使用他汀類藥物治療進(jìn)行比較，聯(lián)合使用PCSK9抑制劑與他汀類藥物對患者進(jìn)行治療，可以減輕冠狀動脈鈣化的形成〔8〕。這一新型藥物的使用，揭開了PCSK9基因與CHD的相關(guān)研究。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/NG_009061.1)資料顯示PCSK9基因共含有12個(gè)外顯子，其中第1外顯子翻譯的氨基酸包含信號肽和部分前片段，對蛋白質(zhì)的成熟具有重要的作用〔9〕。研究結(jié)果表明PCSK9基因編碼的蛋白可以通過介導(dǎo)血脂調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生物學(xué)功能等環(huán)節(jié)參與CHD的發(fā)生發(fā)展過程，而PCSK9基因突變則可能通過改變其編碼蛋白合成、成熟和分泌過程，或者改變編碼蛋白的功能介導(dǎo)CHD發(fā)病。目前國外文獻(xiàn)報(bào)道已發(fā)現(xiàn)PCSK9基因第1外顯子上存在V4I、21-22ins、E32K和AV53等突變位點(diǎn)〔10，11〕。本試驗(yàn)在黑龍江省東部地區(qū)漢族人群的基因篩查中共發(fā)現(xiàn)c.121C>G、c.299C>T、c.427-428insGCT、A53V、P56S和c.556A>G 6個(gè)突變位點(diǎn)，其中c.121C>G、c.299C>T和c.556A>G突變位點(diǎn)在國內(nèi)外研究中尚未見相關(guān)報(bào)道，目前尚不明確其突變后對編碼蛋白及CHD的影響。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)國外文獻(xiàn)已報(bào)道的框移突變位點(diǎn)c.427-428insGCT和錯(cuò)義突變A53V和P56S，但未發(fā)現(xiàn)V4I、21-22ins、E32K突變位點(diǎn)，推測可能是由于這些突變位點(diǎn)在該人群中突變頻率極低所致。

在Gutierrez-Cirlos等〔10〕和Ohta等〔11〕的研究中發(fā)現(xiàn)PCSK9基因A53V位點(diǎn)與家族性高膽固醇血癥有關(guān)，然而在我國首次發(fā)現(xiàn)PCSK9基因A53V多態(tài)性位點(diǎn)的家族性高膽固醇血癥患者當(dāng)中未發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性基因位點(diǎn)與家族性高膽固醇血癥有關(guān)，推測這可能是由于PCSK9基因?qū)易逍愿吣懝檀佳Y的影響受其他因素的調(diào)控〔12〕。此外，Miyake等〔13〕發(fā)現(xiàn)A53V在高LDL-C和低LDL-C人群中均有分布，且該多態(tài)性位點(diǎn)的突變可以影響其編碼蛋白折疊和分泌從而影響LDL-C水平〔14〕，這一結(jié)論與Mayne等〔15〕的研究結(jié)果一致。本研究與上述研究結(jié)果相同，表明PCSK9基因A53V位點(diǎn)突變與CHD患者脂代謝異常相關(guān)。

綜上，PCSK9是研究心血管疾病的一個(gè)重要基因，對于進(jìn)一步了解疾病的遺傳規(guī)律，篩選易感人群進(jìn)行疾病的預(yù)防治療具有重要意義。隨著遺傳分子學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對于PCSK9基因組學(xué)的研究將不斷深入，有望發(fā)現(xiàn)更多與CHD相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，并進(jìn)一步研究作用機(jī)制，從而打開基因靶向藥物治療的大門，開創(chuàng)CHD個(gè)體化治療的新時(shí)代。