梁志慶 倪凱 李文琦

摘要：目的 研究佤族肝病用藥針對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6增值和活力的影響從而篩選出有效的抗肝纖維化藥物。方法 采用Celigo Cytomter全視野細(xì)胞掃描分析儀，直接對(duì)健康生長(zhǎng)條件下空白組及分別以不同濃度給予等量不同藥的給藥組肝星狀細(xì)胞進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)細(xì)胞增值和活力的觀察分析，篩選出具有顯著抑制肝星狀細(xì)胞增值的藥材。結(jié)果 給藥組肝星狀細(xì)胞HSC-T6的細(xì)胞數(shù)目少于空白組肝星狀細(xì)胞HSC-T6的細(xì)胞數(shù)目。結(jié)論 佤族肝病用藥對(duì)肝星狀細(xì)胞有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞：佤藥;肝纖維化;肝星狀細(xì)胞;篩選

中圖分類(lèi)號(hào)：R29 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? 文章編號(hào)：1007-2349（2020）02-0087-03

肝纖維化（Hepatic fibrosis，HF）是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同病理過(guò)程和發(fā)展途徑，是肝臟對(duì)各種損傷所產(chǎn)生的一種修復(fù)反應(yīng)，其主要特征表現(xiàn)為肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells，HSC）的大量增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在肝臟內(nèi)過(guò)度沉積特別是膠原的過(guò)度合成。在肝纖維化的早期，肝星狀細(xì)胞由“靜止”轉(zhuǎn)變?yōu)椤盎罨钡募〕衫w維細(xì)胞（myofibroblast，MFB），隨后活化的肝星狀細(xì)胞過(guò)度增殖并大量合成各種細(xì)胞外基質(zhì)成分[1-2]。肝星狀細(xì)胞（HSC）是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，是肝纖維化的效應(yīng)細(xì)胞，也是細(xì)胞外基質(zhì)的主要產(chǎn)生細(xì)胞，其活化是肝纖維化形成的開(kāi)端[3-4]。因此，臨床主要通過(guò)抑制HSC活化和促進(jìn)HSC凋亡來(lái)逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程。在前期調(diào)研過(guò)程中，課題組發(fā)現(xiàn)佤族藥治療肝病具有本民族的特色和優(yōu)勢(shì)，近些年已在單味中藥、單驗(yàn)方等方面取得了一定的進(jìn)展。在佤族地區(qū)，民間佤醫(yī)非常注重鮮品藥物（以植物藥為主）的使用，在使用鮮品藥物中常用的劑型有湯劑、飲劑、外包劑、外搽劑、外洗劑等。肝炎則多用日不給杏、努公把、日不潤(rùn)卜歪、日不安里。德娘百艾（均為佤名）等[5-7]。

課題組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中正是選擇了20余種佤族治療肝病的習(xí)用藥材，進(jìn)一步在肝星狀細(xì)胞HSC-T6上進(jìn)行驗(yàn)證分析，通過(guò)Celigo Cytomter全視野細(xì)胞掃描分析儀對(duì)健康生長(zhǎng)條件下的肝星狀細(xì)胞以及給藥之后的不同時(shí)間段的肝星狀細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行觀察分析總結(jié)，得出最后結(jié)論?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞株購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)（編號(hào)：KCB200703YJ）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 實(shí)驗(yàn)用佤藥共26種，隨機(jī)數(shù)字編號(hào)為1到26號(hào)，批號(hào)：20190505，均購(gòu)自于滄源縣中醫(yī)佤醫(yī)醫(yī)院;中美特級(jí)胎牛血清（1829596）、DMEM/高糖培養(yǎng)液（0010219）、青霉素-鏈霉素溶液（1843964）、胰蛋白酶溶液（00034618）上述試劑均購(gòu)自云南澤浩商貿(mào)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Celigo Cytomter全視野細(xì)胞掃描分析儀，美國(guó)Nexcelom，耐細(xì)隆生物儀器（上海）有限公司;真空操作臺(tái)，AIRTECH;OLYMPUS BX600顯微鏡，奧林巴斯（北京）銷(xiāo)售服務(wù)有限公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)SHELLAB;DLAB離心機(jī)，型號(hào)：DM0412，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司;超純水系統(tǒng)，英國(guó)ELGA Classic UF;-80℃超低溫冰箱，Ermo Fisher;TGL16M冷凍高速離心機(jī) Eppendow。

1.4 藥材前處理 隨機(jī)抽選編號(hào)5，8，10，23，24共5種藥材每種各100g，按1：10的比例加水，煎煮30分鐘，濾出藥液。取藥渣再按上述方法提取兩次，合并三次濾液，濃縮濾液至20ml，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。最后藥物濃度? g/mL的原液，在80℃水浴30分鐘、連續(xù)3天高溫滅活后，1000 rpm離心10分鐘，-20℃凍存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)臨用時(shí)用DMEM培養(yǎng)基溶解藥物為20 mmol/L母液濃度后，倍比稀釋至3 個(gè)濃度（200、400、800 μg/mL）三組備用。

1.5 受試藥材對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力的影響 將HSC-T6細(xì)胞消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞，將每組細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中。然后放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后分別加入等量受試藥材，每種藥材分別設(shè)3個(gè)濃度組（200、400、800 μg/mL），用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，空白組加入等量培養(yǎng)基，分別在藥材刺激后24 h，48 h，72 h取出96孔板，用Celigo Cytomter全視野細(xì)胞掃描分析儀檢測(cè)細(xì)胞增值和細(xì)胞活力情況，從而評(píng)價(jià)藥物對(duì)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，篩選出對(duì)其增殖具有顯著抑制作用的藥材。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各組均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，符合正態(tài)分布、方差齊用方差分析，方差不齊用非參數(shù)檢驗(yàn)，P>0.05為差異無(wú)顯著性意義，P<0.01為差異有非常顯著性意義，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的5號(hào)佤藥對(duì)平均細(xì)胞數(shù)的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，佤藥A中、高濃度對(duì)肝星狀細(xì)胞數(shù)有影響，兩組肝星狀細(xì)胞數(shù)呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，與空白組比較，中濃度組在48～72 h時(shí)，P<0.05為差異有顯著性意義，高濃度組在0～72 h時(shí)，P<0.01為差異有非常顯著性意義，低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2 不同濃度的8號(hào)佤藥對(duì)平均細(xì)胞數(shù)的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，佤藥B中、高濃度對(duì)肝星狀細(xì)胞數(shù)有影響，兩組肝星狀細(xì)胞數(shù)呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，與空白組比較，高中濃度組在0～72 h時(shí)，P<0.01為差異有非常顯著性意義，低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.3 不同濃度的10號(hào)佤藥對(duì)平均細(xì)胞數(shù)的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，佤藥C各劑量濃度對(duì)肝星狀細(xì)胞數(shù)均無(wú)有影響，肝星狀細(xì)胞數(shù)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，與空白組比較，各劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

2.4 不同濃度的佤藥23號(hào)對(duì)平均細(xì)胞數(shù)的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，佤藥D中、高濃度對(duì)肝星狀細(xì)胞數(shù)有影響，兩組肝星狀細(xì)胞數(shù)呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，與空白組比較，中濃度組在48～72 h時(shí)，P<0.05為差異有顯著性意義，高濃度組在0～72 h時(shí)，P<0.01為差異有非常顯著性意義，低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4。

2.5 不同濃度的佤藥24號(hào)對(duì)平均細(xì)胞數(shù)的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，佤藥E中、高濃度對(duì)肝星狀細(xì)胞數(shù)有影響，兩組肝星狀細(xì)胞數(shù)呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，與空白組比較，中濃度組在48～72 h時(shí)，P<0.05為差異有顯著性意義，高濃度組在0～72 h時(shí)，P<0.01為差異有非常顯著性意義，低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表5。

3 討論

通過(guò)調(diào)研搜集了20余種佤藥，均為當(dāng)?shù)刎翎t(yī)常用的肝病用藥，進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)，隨機(jī)抽選5種藥材進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的初篩，下一步擬擴(kuò)大篩選范圍，以期發(fā)掘更多治療肝病有效的佤藥。5號(hào)藥的功效為清熱解毒，利水消腫，佤族地區(qū)常用于治療急性黃疸型肝炎;8號(hào)藥的功效為益氣健脾，清熱安神，佤族地區(qū)常用于治療病毒性肝炎;10號(hào)藥的功效為祛風(fēng)除濕，續(xù)筋接骨，佤族地區(qū)常用于治療黃疸型肝炎;23號(hào)藥的功效為清熱解毒，利濕退黃，佤族地區(qū)常用于治療濕熱黃疸;24號(hào)藥的功效為清熱解毒，佤族地區(qū)常用于治療各型肝炎[8]。實(shí)驗(yàn)表明，除了藥物C外，其余藥物均對(duì)肝星狀細(xì)胞的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，且BDE三個(gè)藥物的高濃度組在0-72h時(shí)均有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明對(duì)治療肝纖維化具有一定的臨床意義。但本實(shí)驗(yàn)依然存在一些實(shí)際性的問(wèn)題，由于佤族習(xí)用肝病用藥一直以來(lái)僅作為云南少數(shù)民族地區(qū)的治療肝病用藥，對(duì)于這些藥的深入研究比較少，尤其是作用到細(xì)胞上更是缺乏研究，所以在濃度的設(shè)定上沒(méi)有一個(gè)規(guī)定的參照標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3個(gè)濃度，通過(guò)觀察其在兩個(gè)濃度區(qū)間的作用效果，可對(duì)佤族習(xí)用肝病用藥有效抑制濃度在一個(gè)大的濃度區(qū)間進(jìn)行初步篩選，所篩選得到的濃度并不一定是佤族習(xí)用肝病用藥的最佳抑制濃度，為得到這些藥的最佳抑制濃度可在不同濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本文在此不再贅述;其次本次實(shí)驗(yàn)載體為大鼠肝星狀細(xì)胞，還未對(duì)活體大鼠進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)，故無(wú)法排除所測(cè)得的濃度以不同方式給藥對(duì)活體大鼠中肝星狀細(xì)胞抑制作用情況的影響。

佤族聚居地多屬于亞熱帶低緯度地區(qū)，雨量充沛，山多林密，氣候溫?zé)?，適合多種動(dòng)植物生長(zhǎng)，豐富的動(dòng)植物是佤藥的來(lái)源。佤族醫(yī)藥作為我國(guó)民族醫(yī)藥的重要組成部分，皆起源于生產(chǎn)、生活和醫(yī)療實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，在漫長(zhǎng)的歷史發(fā)展過(guò)程中，為本民族防病治病、生存繁衍，起到了重要的作用，至今仍在廣泛應(yīng)用。只有進(jìn)一步對(duì)佤族醫(yī)藥進(jìn)行系統(tǒng)的挖掘、整理、分析和研究，才能更好的使之服務(wù)于臨床為人們解除病痛。

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（收高日期：2019-09-12）