楊歌 趙毅 韓詩邈 朱超 黃淵余 屈鋒

摘?要?核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化（SELEX）技術，在體外篩選獲得的與目標分子有高親和力與特異性的寡核苷酸序列。由于篩選過程周期長且影響因素復雜，使用常規(guī)篩選方法進行多因素影響的條件優(yōu)化的工作量大，樣品消耗多，目前還少有系統(tǒng)的研究報道。毛細管電泳（CE）具有高分辨率、快速分離、樣品用量小、篩選成本低的優(yōu)勢，是核酸適配體篩選的有效方法。本研究以人血清中脫鐵轉鐵蛋白（A-TF）為模式蛋白，利用CE方法研究核酸庫長度、孵育溫度、緩沖溶液的種類與pH值、金屬離子等因素對靶蛋白與核酸庫相互作用的影響。結果表明，較短序列的核酸庫與靶蛋白的親和力更高;孵育溫度、緩沖液種類與pH值均影響靶蛋白與核酸復合物的形成;低濃度的K+、Ca2+與Mg2+可促進復合物形成。基于優(yōu)化的篩選條件，經(jīng)過3輪毛細管電泳法篩選，獲得了A-TF的適配體 Seq A3，采用CE-LIF測得復合物的親和常數(shù)KD=0.476 μmol/L。此適配體可用于人血清基質中A-TF的識別。

關鍵詞?脫鐵轉鐵蛋白;核酸適配體篩選;影響因素;毛細管電泳;指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化

1?引 言

核酸適配體（Aptamer）是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化（SELEX）技術體外篩選獲得的寡核苷酸序列[1]，具有類似抗體的高親和力和高特異性的優(yōu)點，且穩(wěn)定性好，容易制備及修飾。核酸適配體的靶標范圍廣，包括金屬離子、小分子、蛋白質、細胞、微生物、病毒等。以蛋白質為靶標的核酸適配體篩選一直受到廣泛關注，蛋白質的適配體在生物醫(yī)學、藥物研發(fā)、醫(yī)學影像和生物檢測等領域的應用已有大量報道[2～4]。由于核酸適配體篩選過程復雜，影響因素多（如蛋白的天然形態(tài)和蛋白濃度以及影響蛋白活性的溶液體系、pH值、離子、其它共存蛋白等），篩選過程的環(huán)境因素直接影響適配體的篩選效率以及適配體的實用性能，因此分析篩選適配體的影響因素，優(yōu)化篩選條件，是提高篩選效率的關鍵問題之一。

文獻報道了通過計算生物學建立數(shù)學模型優(yōu)化適配體篩選的環(huán)境參數(shù)和預測篩選結果，研究者分析了靶標濃度[5，6]、復合物與游離核酸庫的分離效率[7]、靶標與核酸序列的非特異性結合[8]，以及負篩步驟等單因素對篩選效率的影響[9]。但每引入一個參數(shù)變量，計算量會巨增[10]，普通的篩選者無法使用類似的數(shù)學模型完成篩選條件的優(yōu)化和預測，特別是數(shù)學模型的預測結果最終仍需大量實驗結果加以驗證。McKeague等[11]比較了429篇文獻中的SELEX實驗條件，認為靶標與孵育溫度對適配體的親和力影響最大，溶液中Mg2+濃度也有重要影響。目前，絕大多數(shù)的核酸適配體的篩選條件都是參考前期文獻中的篩選條件[12～14]。實際上，不同蛋白質的性質、結構和功能不盡相同，需針對特定蛋白研究篩選環(huán)境的條件因素影響，設計針對性的篩選條件，以提高篩選效率。可能是由于常規(guī)的實驗和方法系統(tǒng)研究多種因素的影響需要極大的工作量和樣品消耗，目前還很少有較系統(tǒng)的研究報道。

毛細管電泳（CE）技術具有高分辨、快速分離、樣品用量小、篩選成本低的優(yōu)勢，是核酸適配體篩選的有效方法。本課題組長期致力于毛細管電泳篩選核酸適配體的策略和方法研究[15]，積累了大量用于蛋白質適配體篩選的毛細管電泳特征圖譜，建立了多種毛細管電泳高效篩選模式，使蛋白質的核酸適配體篩選效率顯著提高。轉鐵蛋白（Transferrin，TF）是血漿中主要的含鐵蛋白，在跨膜轉運中起著至關重要的作用[16]。脫鐵轉鐵蛋白（Apo-transferrin，A-TF）是轉鐵蛋白的全脫鐵狀態(tài)，具有多種功能，如螯合游離鐵將藥物遞送至快速生長的細胞、激活免疫細胞和防止細胞凋亡等[17，18]，但至今還沒有利用CE進行核酸適配體篩選的報道。利用CE可系統(tǒng)研究和優(yōu)化適配體的篩選條件，并進行高效篩選。本研究考察了單鏈核酸庫（ssDNA）的序列長度、蛋白與核酸庫的孵育溫度、緩沖液的種類與pH值、金屬離子等因素對靶蛋白與核酸序列相互作用的影響。在優(yōu)化的篩選條件下，經(jīng)過3輪CE-SELEX篩選，得到A-TF的適配體seq A3。此適配體對A-TF有良好的親和力和特異性，可用于血清中的A-TF識別。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀配熒光檢測器（美國Beckman-coulter公司）;MicroCal iTC200微量熱等溫滴定量熱儀（英國馬爾文儀器公司）;PICO 21低溫離心機（美國賽默飛世爾科技有限公司）;?S1000TM Thermal Cycler PCR儀、凝膠電泳儀（美國BIO-RAD公司）;75 μm內徑熔融石英毛細管（邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司）。

H3BO3、Na2B4O7、NaOH、NaCl、KCl（分析純，北京化工廠）;?NaH2PO4、Na2HPO4（國藥集團化學試劑有限公司）;三羥甲基氨基甲烷（Tris）、CaCl2（天津市津科化工研究所）;A-TF、人血清白蛋白（Human serum slbumin，HSA）、人血紅蛋白（Hemoglobin，HGB）（Sigma-Aldrich公司）。實驗用水為二次蒸餾水（ddH2O）

55、69、80和100 nt FAM標記ssDNA核酸庫：5-FAM-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-（15N，29N，40N or 60N）-CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3（兩端為20 nt引物區(qū)，中間為隨機序列）。引物P1：5-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3，標記熒光的引物5-FAM-P1：FAM-5-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3），引物P2：5-TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3（生工生物工程（上海）股份有限公司）。2×Taq Plus PCR Master Mix、dd H2O、500 μL Nuclelc Acid Dye Gene Green、1mL 6×DNA Loading Buffer、300 μL 50 bp DNA Ladder、50 g瓊脂糖（天根生化科技有限公司）。

2.2?實驗方法

2.2.1?溶液配制?（1）毛細管電泳分離溶液?50 mmol/L硼酸硼砂緩沖液（pH 8.7）。（2）蛋白與核酸孵育溶液?1/15 mol/L Na2HPO4-KH2PO4溶液（pH 4.92、5.91、6.64、7.17、7.38、7.73、8.43、8.98）;PBS、Tris-HCl、TGK、Na2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH 7.4）。（3）蛋白與核酸溶液?蛋白質用孵育緩沖溶液稀釋。固體粉末核酸庫用純水溶解，配制成100 μmol/L的母液，于94℃變性處理5 min，然后以0.5℃/s冷卻至25℃。

2.2.2?毛細管電泳分析條件?75 μm內徑毛細管（ 50.2 cm/40 cm），使用前依次用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaOH 和蒸餾水沖洗30 min進行活化;LIF檢測器激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長520 nm;50 mmol/L硼酸鹽電泳緩沖液（pH 8.7）;0.5 psi（1 psi=6.89 kPa），進樣5 s;分離電壓20 kV，溫度25℃。

2.2.3?PCR擴增和產(chǎn)物純化?（1）PCR條件?300 nmol/L引物P1、P2各6 μL，收集模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 11 μL。95℃預變性5 min，變性10 s，59℃退火20 s，72℃延伸30 s;循環(huán)20次后，72℃后延伸10 min。（2）PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳?取RCR產(chǎn)物5 μL與6×DNA Loading Buffer 1 μL混合均勻后依次注入凝膠進樣孔，80 V下電泳30 min，用凝膠成像分析儀拍照記錄。（3）PCR產(chǎn)物濃縮?PCR產(chǎn)物于2.0 mL的離心管中，加入40 μL 3 mol/L醋酸鈉溶液（pH 5.2）混勻;加入20℃預冷的900 μL無水乙醇混勻，15000 r/min離心15 min;加入70%乙醇洗滌沉淀，棄乙醇，沉淀干燥;（4）PCR產(chǎn)物回收?切下瓊脂糖凝膠電泳上所需條帶，轉入1.5 mL離心管中，離心后于20℃冰凍20 min，搗碎;加入500 μL ddH2O，振搖多次;加入500 μL Tris飽和純苯酚，振搖后離心;取新離心管，加入500 μL 氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），再加入上清液，振搖后離心;取新離心管，加入無水乙醇900 μL、 3 mol/L醋酸鈉20 μL，加入上清液后混勻，離心，棄去上清液，沉淀物于室溫風干。

2.2.4?序列分析與親和力表征?高通量測序由生工生物公司完成，使用DNAman軟件分析序列二級結構。CE法計算核酸序列與蛋白的結合比。利用GraphPad Prism 6 軟件按1∶1模型，擬合非線性飽和曲線，計算平衡解離常數(shù)（Dissociation constant，KD）。

2.2.5?CE法驗證親和力與特異性?將篩選的核酸適配體序列加入含有A-TF（0.1～2 μmol/L）的人血清50倍稀釋液樣本中，37℃孵育20 min。以CE-LIF檢測復合物，計算適配體序列與A-TF的結合比，利用Origin 2018軟件，對結合百分比隨A-TF濃度變化擬合非線性飽和曲線，計算KD。相同條件下，將核酸適配體序列分別與HSA、HGB孵育，利用CE-LIF分析核酸適配體的特異性。

3?結果與討論

3.1?不同長度隨機序列的核酸庫與蛋白A-TF和HSA的結合分析

目前報道的篩選用核酸庫的隨機序列含堿基數(shù)最短22 nt[19]，最長200 nt[20]，應用最普遍的是40～70 nt[11]。Velez等[21]驗證了核酸酶對不同長度核酸序列的催化活性，但有關核酸庫序列長度對靶標復合物形成和適配體篩選的影響還沒有系統(tǒng)的研究報道，而通過CE電泳圖可評價不同長度核酸庫與A-TF結合的差異，分析核酸庫長度對A-TF-核酸復合物形成的影響。圖1為A-TF分別與4個不同隨機序列長度（60、40、29和15 nt）核酸庫ssDNAN60、ssDNAN40、ssDNAN29、ssDNAN15孵育后的混合物的電泳圖。與初始ssDNAN60核酸庫峰高相比，加入A-TF后，4.6 min處的ssDNAN60核酸庫峰高沒有明顯降低，也沒有明顯的復合物峰出現(xiàn)。ssDNAN40的結果與ssDNAN60相似。但更短的核酸庫 ssDNAN29、ssDNAN15與A-TF混合物的電泳圖中，可見核酸庫峰高有明顯降低，且3～4 min區(qū)間有明顯的復合物包峰，其隨A-TF濃度增加而增大。以HSA蛋白為對照蛋白，將A-TF換成HSA蛋白，結果與A-TF相似（圖1B）。兩種蛋白均與短序列的核酸庫有結合，使核酸庫峰降低并形成較明顯的復合物峰，說明較短的核酸庫中存在較多可與兩種靶蛋白結合的序列，它們分別形成A-TF-ssDNA復合物和HSA-ssDNA復合物。目前大量的篩選實驗均使用ssDNAN60或ssDNAN40，但并未有選擇依據(jù)的說明或研究。從CE電泳圖可見，核酸庫長度對復合物的形成有明顯影響，說明不同序列長度的核酸庫對蛋白的結合能力有所不同，但是否會影響最佳適配體的篩選目前并無報道。根據(jù)此前的研究結果，適配體篩選前應對核酸庫長與蛋白靶標的結合進行評估，以優(yōu)選核酸庫和其它篩選條件?？紤]到評估的效率和成本，CE無疑是最佳方法。本實驗以長度居中的隨機序列長度29 nt（研究最充分的人凝血酶的適配體的長度），總長度69 nt的ssDNAN29核酸庫研究適配體篩選的影響因素。

3.2?孵育溫度對A-TF-ssDNA和HSA-ssDNA 復合物形成的影響

單鏈核酸具有很大的柔性，其結構易受環(huán)境因素影響，如溶液溫度會顯著影響其二級和三級結構，也影響其與靶標的結合能力。適配體篩選前需要對核酸庫進行高溫變性和低溫復性，以保持其穩(wěn)定的結構并能與蛋白結合。孵育溫度不僅影響篩選過程中靶標與核酸的結合，也影響實際應用中適配體對靶標的識別效果，因此篩選適配體時必須考慮孵育溫度的影響。文獻報道中常用的孵育溫度為4℃、25℃和37℃。4℃時大部分的細胞或蛋白可保持活性[22，23];25℃是室溫條件[24，25]，是常規(guī)實驗用溫度;37℃則是生理溫度[26，27]。考察了3種孵育溫度對兩種蛋白的復合物形成的影響。由圖2A可見，隨孵育溫度升高，A-TF-ssDNA復合物峰明顯增加，37℃形成的復合物最多。HSA復合物形成情況相似。因此，溫度變化對適配體與蛋白的結合影響很大。篩選適配體的溫度條件與應用適配體的溫度條件如果不一致，可能會使適配體因結構變化而導致親和力弱化甚至喪失，CE分析結果為此提供了參考。目前很多文獻報道的適配體，在應用時效果不佳甚至沒有親和力，部分原因可能是篩選條件和應用環(huán)境的不一致，包括篩選和應用時不同溫度的影響。

3.3?緩沖溶液組成和pH值對A-TF-ssDNA復合物形成的影響

蛋白與核酸庫孵育的緩沖溶液及pH值也影響復合物的形成。緩沖溶液和pH的選擇并沒有明確的標準和依據(jù)，篩選者所用溶液條件多參考前期的文獻[28]。常用緩沖溶液有PBS、Tris-HCl、TGK、Na2HPO4-KH2PO4等，分別在這些溶液中將A-TF與ssDNA混合孵育。由圖3A可見，在Na2HPO4-KH2PO4中，A-TF與核酸形成明顯的復合物包峰，其它3種溶液中則未檢出復合物峰。改變Na2HPO4-KH2PO4溶液的pH值 （pH 4.92～8.98），該復合物峰無明顯變化（圖3B），說明此緩沖液中，pH值對A-TF與核酸的結合影響較小，表明A-TF與ssDNA庫孵育可選用的溶液pH范圍很寬，有利于適配體的篩選和實際應用。

3.4?金屬離子對A-TF-ssDNA復合物形成的影響

溶液中一定濃度的陽離子可以穩(wěn)定核酸的二級結構[29]，中和ssDNA骨架上的負電荷，排除其與蛋白質的靜電作用，但也可能影響蛋白質的荷電性和二級或三級結構，繼而影響蛋白與ssDNA的結合[24]。已有報道，金屬離子對蛋白與ssDNA的結合有明顯的影響[30]，但系統(tǒng)的研究方法和報道不多。目前報道的適配體篩選溶液中，通常含有Na+、K+、Ca2+、Mg2+或幾種陽離子的組合。K+、Ca2+、Mg2+濃度為1～5 mmol/L[31，32]，Na+濃度為2～150 mmol/L[33～35]。比較了溶液中K+、Ca2+與Mg2+對A-TF-ssDNA 復合物形成的影響。由圖4A可見，溶液中K+為0～1 mmol/L時，電泳圖中有復合物峰。K+大于10 mmol/L，復合物包峰消失。溶液中含1 mmol/L Ca2+與1 mmol/L K+相似，但含10～50 mmol/L Ca2+時，復合物峰幾乎消失，而含100～150 mmol/L Ca2+時，又出現(xiàn)更大的復合物峰（圖4B），說明不同濃度的Ca2+對復合物形成的影響不同。推測是由于高濃度的Ca2+ 可能影響A-TF或核酸的二級結構，但具體原因還需進一步探討。而Mg2+濃度的影響與K+非常相似（圖4C），與同為二價的Ca2+的影響有明顯差異。CE的分析結果表明，篩選中使用1～5 mmol/L K+、Ca2+、Mg2+可促進復合物的形成。由于CE的背景緩沖液為50 mmol/L硼酸硼砂緩沖液（pH 8.7），含有50 mmol/L Na+，故分離過程中也可保持一定的離子濃度。上述結果也表明，不同的蛋白質篩選適配體時，篩選溶液中的金屬離子對蛋白與核酸結合的影響可能存在很大差異，篩選時應考慮溶液中離子種類和強度的影響。此外，在不同的實際樣品環(huán)境中，陽離子類型和濃度復雜多變，所篩選的適配體的結構可能受其影響而改變，進而影響適配體與靶蛋白的結合。因此，適配體在應用時如果效果不佳，甚至沒有親和力，離子種類和強度可能也是影響原因之一。

3.5?分析電壓和溫度對復合物分離的影響

對蛋白與核酸庫孵育的混合物進行CE分析，可根據(jù)CE電泳圖譜快速、直觀地評估蛋白-ssDNA復合物的形成及定性評價結合強弱。進一步考察了電泳分離過程中分離電壓和分離溫度對復合物穩(wěn)定性的影響。以50 mmol/L硼酸硼砂緩沖液（pH 8.7）為背景溶液，改變分離溫度（15℃～45℃）和分離電壓（15～30 kV），比較復合物峰的變化。當分離溫度由15℃逐漸增加至45℃，ssDNA和復合物的遷移速度明顯加快，遷移時間明顯縮短，且二者的峰形尖銳，柱效明顯提高。在30℃～45℃分離溫度下，復合物的峰面積保持不變，說明A-TF-ssDNA復合物穩(wěn)定，結果與孵育溫度37℃形成的復合物最多一致。增加分離電壓也可加快分離速度，30 kV電壓可使復合物的遷移時間縮短到2 min。因此，在優(yōu)化的溶液條件下，使用較高的分離溫度（35℃～37℃）和較高電壓可加快復合物的分離速度，節(jié)省分離時間。

3.6?A-TF的核酸適配體篩選

在優(yōu)化的CE條件下（緩沖液10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4，pH 7.17，含0.1 mmol/L Mg2+，37℃孵育10 min），用總長為69 nt的ssDNAN29核酸庫篩選A-TF的核酸適配體。第1輪篩選用10 μmol/L A-TF與1 μmol/L ssDNAN29庫混合孵育。收集復合物，經(jīng)不對稱PCR擴增，ssDNA純化，得到次級庫（Sub1-ssDNA）用于第2輪篩選。第2輪篩選用5 μmol/L A-TF與Sub1-ssDNA次級庫混合。其CE結果見圖6A。3.8～5.4 min區(qū)間有復合物峰，收集復合物進行PCR擴增，產(chǎn)物的凝膠電泳如圖6A右圖所示。由于ssDNAN29樣品的模板濃度過高，其PCR產(chǎn)物條帶彌散，而擴增產(chǎn)物R2條帶長度在50～100 bp之間，為目標產(chǎn)物。切膠回收純化后，獲得了新的次級庫Sub2-ssDNA，用于第3輪篩選。第3輪篩選用2.5 μmol/L A-TF與Sub2-ssDNA次級庫混合。如圖6B所示，3.6～5.2 min區(qū)間為復合物峰。收集復合物進行PCR擴增，產(chǎn)物的凝膠電泳如圖6B右圖所示，其中R3為PCR擴增產(chǎn)物，而擴增產(chǎn)物R3條帶長度在50～100 bp之間，為目標產(chǎn)物。

將第3輪篩選得到的PCR產(chǎn)物進行高通量測序。選擇出現(xiàn)頻數(shù)最高的3條序列Seq A1～Seq A3，用M-fold模擬序列的二級結構，結果顯示，這些序列普遍呈莖環(huán)結構（圖7A）。對3條序列Seq A1、Seq A2、Seq A3用 CE方法表征親和力

并計算其復合物的KD值。根據(jù)A-TF與3條序列的結合百分比，用1∶1結合模型做線性擬合，得到Seq A1、Seq A2、Seq A3的KD值分別為3.338、1.550和0.476 μmol/L（圖7B）。選親和力最高的Seq A3為其適配體。

3.7?Seq A3用于血清中A-TF的特異性識別和檢測

A-TF為血清蛋白，HSA、HBG也是血清中高豐度蛋白，故在血清樣品中驗證Seq A3對A-TF的高親和和特異性識別。在3份稀釋50倍的人血清樣品中分別加入1 μmol/L的A-TF、HSA和HBG，得到3個加標的血清稀釋樣品。分別將0.2 μmol/L的Seq A3加入3個樣品，在37℃孵育20 min，用CE-LIF分析。由圖8A可見，Seq A3可與含A-TF的樣品形成明顯的復合物（PA），而含HSA和HBG的樣品中未見明顯的復合物峰，說明在稀釋的血清基質中，Seq A3對A-TF有特異性的識別。分別在稀釋血清中加入0.1，0.2，0.5，1，2，5 μmol/L A-TF，將0.2 μmol/L Seq A3作為熒光探針與其混合。隨著A-TF濃度的增加，游離Seq A3峰降低，而復合物（PA）峰增加（圖8B），加入A-TF的濃度與Seq A3峰的降低百分比呈線性關系（圖8C）。說明篩選的Seq A3可識別血清中的A-TF，其用于實際檢測還需進一步深入研究。

4?結 論

核酸適配體篩選過程復雜，影響篩選的因素很多。分析篩選因素的影響，優(yōu)化篩選條件，是提高篩選效率的關鍵。毛細管電泳是直觀、快速、優(yōu)化篩選條件的有效方法。基于毛細管電泳方法可系統(tǒng)研究核酸庫隨機序列長度、蛋白與核酸庫的孵育溫度、緩沖液種類與pH值、金屬離子等因素對靶蛋白與核酸序列相互作用的影響，并可用于篩選條件優(yōu)化。毛細管電泳方法較常規(guī)篩選方法大大減少了工作量和研究成本，可用于蛋白質靶標的適配體篩選條件研究，方法具有普適性。A-TF是重要的生物功能蛋白，其核酸適配體Seq-A3可以選擇性識別人血清基質中的A-TF。

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