田潤(rùn) 陶晴 卞曉軍 朱福琳 顏娟

摘?要?基于醛基化磁珠顆粒 （Aldehyde magnetic beads，AMBs）和DNA 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）的信號(hào)放大策略，設(shè)計(jì)了檢測(cè)卡那霉素（Kanamycin，Kana）的比色適配體生物傳感器（Aptasensor）。制備了Mbs@DNA復(fù)合物，其上的卡那霉素適配體鏈與卡那霉素發(fā)生特異識(shí)別后，釋放出互補(bǔ)鏈，互補(bǔ)鏈含有設(shè)計(jì)好的引發(fā)序列，可作為信號(hào)探針，引發(fā)HCR反應(yīng)，生成的雙鏈DNA（Double-stranded DNA，dsDNA）表現(xiàn)出強(qiáng)負(fù)電性，與溶液中帶負(fù)電金納米顆粒（Goldnanoparticles，AuNPs）相互排斥，在高鹽條件下，AuNPs的穩(wěn)定性被破壞而發(fā)生聚集，導(dǎo)致溶液的顏色從紅色變?yōu)樽仙?，吸收光譜也發(fā)生變化。本方法檢測(cè)卡那霉素的線性范圍為1.6～32.0 nmol/L，檢出限為0.9 nmol/L（S/N = 3）;實(shí)際樣品牛奶和蜂蜜樣品中卡那霉素的加標(biāo)回收率在96.0%～105.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.3%～5.0%之間，說(shuō)明本方法實(shí)用性良好。本方法對(duì)卡那霉素的檢測(cè)具有較高的靈敏度和特異性，操作簡(jiǎn)單便捷，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等。同時(shí)，根據(jù)不同待測(cè)物具有與其特異性結(jié)合的適配體，本方法為其它目標(biāo)物的檢測(cè)提供了參考，在食品安全檢測(cè)與監(jiān)管中具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞?卡那霉素;雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng);核酸適配體;金納米顆粒;食品安全

1?引 言

卡那霉素（Kanamycin，Kana）是一種氨基糖苷類抗生素，因其價(jià)格低廉、抗菌活性好，常作為飼料添加劑或治療劑，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及水產(chǎn)業(yè)中[1，2]。然而，卡那霉素的濫用會(huì)造成其在動(dòng)物源性食品中殘留，長(zhǎng)期攝入含有卡那霉素殘留的食品，會(huì)引起毒性、腎毒性及抗生素耐藥性等副作用[3]。歐盟和日本等國(guó)際組織和國(guó)家明確規(guī)定了動(dòng)物源性制品中卡那霉素的最大殘留量≤200 μg/kg[4，5]，牛奶中的最大殘留量為200 μg/kg[6]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量GB 2763-2016》[7]對(duì)其在食品中的殘留量也做了明確規(guī)定。

目前，對(duì)卡那霉素的檢測(cè)技術(shù)有酶聯(lián)免疫法[8]、高效液相色譜法[9]、毛細(xì)管電泳法[10]?等，這些方法雖然準(zhǔn)確度高，但需要昂貴的大型設(shè)備和專業(yè)的操作人員，以及復(fù)雜的前處理過(guò)程，耗時(shí)長(zhǎng)。因此，需要建立快速、靈敏、低成本的檢測(cè)食品中卡那霉素殘留的方法。

適配體是通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選出來(lái)的單鏈寡核苷酸片段，可與各種靶標(biāo)（如小分子，抗生素和細(xì)胞等）發(fā)生特異性識(shí)別并結(jié)合，形成穩(wěn)定復(fù)合物[11]。與抗原抗體相比，適配體的生物穩(wěn)定性更好，而且制備簡(jiǎn)便、特異性好、親和性高，基于適配體的生物傳感器已被廣泛應(yīng)用[12]。但是，僅依靠適配體捕獲靶標(biāo)后引起的構(gòu)象變化產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的策略[7]，在生物檢測(cè)分析中的應(yīng)用較為有限。多種核酸信號(hào)放大技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）[13]、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling circle amplification，RCA）[14]、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[15]?以及雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）[16]?的使用，大大提高了適配體生物傳感器的檢測(cè)靈敏度。目前，雖有很多文獻(xiàn)報(bào)道了采用適配體對(duì)卡那霉素進(jìn)行檢測(cè)的方法[17～19]，然而，這些信號(hào)放大技術(shù)中，PCR技術(shù)需要嚴(yán)格地控制溫度，同時(shí)需要設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物;RCA則需要設(shè)計(jì)及制備環(huán)狀模板;LAMP雖然不需要模板，但需要多條引物;并且這些擴(kuò)增技術(shù)都需要有聚合酶參與反應(yīng)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性信號(hào)，檢測(cè)成本也較高相比之下，雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）是一種自組裝信號(hào)放大的技術(shù)，在常溫下進(jìn)行，且不需要酶參與，操作簡(jiǎn)便，只需通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行的交替雜交的信號(hào)放大技術(shù)。無(wú)酶的參與能夠避免由于酶導(dǎo)致的假信號(hào)出現(xiàn)，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，HCR對(duì)外部條件要求簡(jiǎn)單，不需要額外輔助變溫調(diào)控，在室溫下就可以進(jìn)行反應(yīng)，因此，HCR作為一種簡(jiǎn)單且有效的新型信號(hào)放大策略備受關(guān)注[20～24]。HCR通過(guò)適配體之間的競(jìng)爭(zhēng)雜交，自組裝成核酸納米結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大[16]。HCR的構(gòu)成原件包括引發(fā)探針和兩條可以互補(bǔ)雜交并帶有粘性末端的發(fā)夾型DNA（H1和H2）。當(dāng)沒(méi)有引發(fā)序列時(shí)，H1和H2可以穩(wěn)定存在，但當(dāng)引發(fā)探針出現(xiàn)時(shí)，H1的二級(jí)結(jié)構(gòu)被引發(fā)探針打開(kāi)，H1釋放出的莖端將會(huì)打開(kāi)H2的二級(jí)結(jié)構(gòu)，H2釋放出的莖端與引發(fā)探針的序列相同，又會(huì)打開(kāi)H1的二級(jí)結(jié)構(gòu)，H1和H2如此循環(huán)往復(fù)地被相互打開(kāi)，最后形成一條含有缺口的雜交長(zhǎng)雙鏈共聚物[25]。HCR與各類檢測(cè)技術(shù)都有較好的兼容性，可提高核酸、蛋白、小分子以及重金屬等生物分子檢測(cè)的靈敏度。納米金也具有良好的生物相容性，易于進(jìn)行表面修飾，且具備獨(dú)特的光學(xué)特性，因此，比色法是最早采用金納米粒子進(jìn)行分析檢測(cè)的一種方法，利用金納米粒子的聚集、溶液顏色的改變，反映溶液相中目標(biāo)檢測(cè)物的量[26]。本研究利用HCR反應(yīng)前后，溶液中不同的DNA鏈與納米金之間的相互作用導(dǎo)致的納米金的變色程度，實(shí)現(xiàn)體系中卡那霉素的快速靈敏檢測(cè)。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

UV-2540紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）;Synergy2 SLFPTAD 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）;Mixer 4K渦旋混合器（生工生物工程（上海）股份有限公司）;HCM100-Pro恒溫振蕩金屬浴、D1008掌上離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司）。

四氯金酸水合物（HAuCl4·H2O，百靈威科技公司）;檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;磷酸鹽緩沖液（20 × PBS，pH 7.4～7.6）;Tris-HCL緩沖液（含50 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KCl，pH 7.0）;瓊脂糖M;8600-10氨基磁珠（美國(guó) Polysciences公司）;電泳緩沖液（50×TAE，pH 8.4）;4S Red Plus 核酸染色劑（10000× 水溶液）;牛血清白蛋白（BSA，美國(guó)Amresco公司）;卡那霉素（Kanamycin）、氯霉素（Chloramphenicol）、四環(huán)素（Tetracycline）、氧氟沙星（Ofloxacin）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）均購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。DNA 序列（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其中，H1、H2使用前需先分別加熱到 95℃，并維持5 min，隨即冰上孵育5 min，再于室溫放置2 h后，備用。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?AuNPs的合成?參照文獻(xiàn)[27]的方法，在圓底燒瓶中加入99 mL水、 1 mL 1% 氯金酸，加熱回流直至沸騰，加入 3.5 mL 1%現(xiàn)配的檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng) 20 min 后，停止加熱，室溫下攪拌過(guò)夜，產(chǎn)物于4℃保存，備用。

2.2.2?Mbs@ds-DNA的制備?按照產(chǎn)品說(shuō)明對(duì)磁珠（50 mg/mL，1.5 μmol/L）進(jìn)行活化，使磁珠上的氨基轉(zhuǎn)化為醛基。取80 μL 醛基化磁珠，磁分離，棄上清液。加入160 μL 1×PBS 緩沖液和16 μL 100 μmol/L 氨基修飾的Kana-Aptamer，37℃孵育過(guò)夜后，磁分離，加入200 μL 1×PBS洗滌1次，用2% BSA室溫封閉1 h，磁分離后，沉淀重懸于400 μL 1×PBS 緩沖液中，備用。取8 μL 100 μmol/L Kana-Aptamer的部分互補(bǔ)序列Cs-I加入到92 μL Mbs@Kana-Aptamer中，37℃振蕩孵育2 h，磁分離，用100 μL 1×PBS洗滌1次，重懸在100 μL Tris-HCl溶液中，4℃保存，備用。

2.2.3?卡那霉素的測(cè)定?20 μL MBs@ds-DNA和30 μL不同濃度的卡那霉素，充分混勻后，37℃振蕩孵育40 min。反應(yīng)結(jié)束后，磁分離，上清液中加入 H1、H2（體系終濃度為1 μmol/L）進(jìn)行HCR，37℃孵育2 h。采用AuNPs比色檢測(cè)，取30 μL HCR產(chǎn)物，加入225 μL AuNPs，在室溫下孵育30 min后，加入30 μL 0.3 mol/L NaCl溶液，靜置10 min，測(cè)定體系在520 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

3?結(jié)果與討論

3.1?實(shí)驗(yàn)原理

提出了基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號(hào)放大檢測(cè)卡那霉素的策略，引入磁性生物探針Mbs@ds-DNA，通過(guò)磁分離消除復(fù)雜樣本體系中基質(zhì)干擾。如圖1所示，連接在磁珠上的適配體序列（Kana-Aptamer）作為捕獲探針，與信號(hào)探針（Cs-I）部分互補(bǔ)配對(duì)，形成Mbs@ds-DNA復(fù)合物。卡那霉素存在時(shí)，Mbs@ds-DNA復(fù)合物上的適配體鏈和卡那霉素發(fā)生特異性結(jié)合，釋放出信號(hào)探針。磁分離后，上清液中游離的信號(hào)探針上的引發(fā)鏈部分引發(fā)HCR，生成的ds-DNA結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出強(qiáng)的負(fù)電性，與溶液中帶負(fù)電AuNPs相互排斥。隨著鹽濃度增加，AuNPs的穩(wěn)定性持續(xù)降低，并發(fā)生聚集，導(dǎo)致溶液的顏色從粉色變?yōu)樽仙．?dāng)體系中不存在卡那霉素時(shí)，信號(hào)探針不會(huì)游離到上清液中，單獨(dú)的DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)（H1，H2）不會(huì)發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即穩(wěn)定存在于溶液中，其單鏈粘性末端通過(guò)靜電作用吸附在AuNPs表面上，保護(hù)AuNPs免受高鹽濃度引起的聚集，溶液仍保持紅色。

3.2?MBs@ds-DNA的紫外可見(jiàn)吸收光譜

采用吸收光譜對(duì)MBs@ds-DNA的組裝進(jìn)行表征。如圖2A所示，測(cè)得Kana-Aptamer在260 nm處的紫外吸收峰值為0.933，收集磁珠和Kana-Aptamer連接后的上清液，測(cè)得其在260 nm處的紫外吸收峰值為0.707，紫外吸收值降低，說(shuō)明NH2-Kana-Aptamer成功組裝在醛基化磁珠表面，體系中游離Kana-Aptamer的數(shù)量減少。同理，將MBs@Kana-Aptamer與Cs-I進(jìn)行孵育后，Cs-I在260 nm處的紫外吸收峰值也降低，說(shuō)明MBs@Kana-Aptamer與Cs-I雜交，即MBs@ds-DNA成功制備（圖2B）。

3.3?瓊脂糖凝膠電泳表征

如圖3A所示，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，發(fā)夾探針H1（5 μmol/L）、H2（5 μmol/L）不發(fā)生HCR（泳道1）;Cs-I（2 μmol/L）可與H1雜交，形成很短的雙鏈DNA，進(jìn)行電泳測(cè)試時(shí)，出現(xiàn)小段拖尾，但是，大部分發(fā)夾H1未打開(kāi)（泳道2）;僅存在H2和Cs-I時(shí)，不發(fā)生HCR，故電泳中沒(méi)有拖尾（泳道3）;只有當(dāng)H1、H2、Cs-I同時(shí)存在時(shí)，才會(huì)發(fā)生HCR（泳道4）。分別將無(wú)引發(fā)鏈存在時(shí)HCR體系與加入引發(fā)鏈進(jìn)行HCR體系的液體滴在干凈平整的云母片上，氮?dú)獯蹈珊?，用原子力顯微鏡觀察（圖3B和3C）。在沒(méi)有引發(fā)鏈Cs-I時(shí)，只有發(fā)夾結(jié)構(gòu)H1和H2的微小斑點(diǎn)（圖3B），加入互補(bǔ)鏈條CS-I后，有清晰可見(jiàn)的伸展的ds-DNA長(zhǎng)鏈（圖3C），說(shuō)明發(fā)生了HCR。

3.4?比色生物感器的可行性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證本研究建立的比色檢測(cè)方法，將制備的MBs@ds-DNA復(fù)合物分別與0和15 μmol/L的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液孵育后，磁分離，將上清液進(jìn)行HCR后，再進(jìn)行納米金比色檢測(cè)。當(dāng)存在卡那霉素時(shí)，HCR產(chǎn)物的ds-DNA結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出強(qiáng)的負(fù)電性，與溶液中帶負(fù)電AuNPs相互排斥。隨著鹽濃度增加，AuNPs的穩(wěn)定性持續(xù)降低，并且發(fā)生聚集，導(dǎo)致溶液的顏色從紅色變?yōu)樽仙?。不存在卡那霉素時(shí)，單獨(dú)的DNA發(fā)夾H1、H2的單鏈粘性末端可保護(hù)AuNPs免于高鹽條件下的聚集，溶液仍保持紅色（圖4A）。透射電鏡圖像（圖4B和4C）進(jìn)一步驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)的可行性，當(dāng)卡那霉素濃度由0增加到15 μmol/L后，納米金粒子由良好的分散狀態(tài)（圖4B）變?yōu)榫奂癄顟B(tài)（圖4C）。

3.5?基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的適配體傳感器對(duì)卡那霉素的檢測(cè)性能

采用構(gòu)建的適配體傳感器，檢測(cè)不同濃度的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品。如圖5A中插圖所示，隨著卡那霉素濃度增加（0～800 nmol/L），溶液顏色由紅色逐漸變?yōu)樽仙▓D5A插圖），同時(shí)吸收光譜（圖5A）也隨之發(fā)生紅移。體系在520 nm處的吸光度比值（A0-A）/A（A0和A分別為空白和樣品在520 nm的吸光度）與卡那霉素濃度在1.6～32.0 nmol/L之間呈線性關(guān)系（圖5B），線性方程為y=0.0047x+0.1237（R2=0.9708），檢出限為0.9 nmol/L（S/N=3）。如表2所示，與其它檢測(cè)方法相比，本方法具有操作簡(jiǎn)單、易于觀察檢測(cè)結(jié)果等優(yōu)勢(shì)。

采用本方法檢測(cè)卡那霉素（10 nmol/L）與4種對(duì)照物（氯霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星，1 μmol/L），考察本方法對(duì)卡那霉素檢測(cè)的特異性。如圖5C所示，當(dāng)檢測(cè)4種對(duì)照物時(shí)，納米金溶液顏色無(wú)明顯變化（酒紅色），吸光度比值變化幅度較小;當(dāng)檢測(cè)目標(biāo)卡那霉素時(shí)，溶液顏色由紅色迅速變?yōu)樽仙?，吸光度比值變化尤為明顯。因此，本方法對(duì)卡那霉素檢測(cè)的特異性良好。

3.6?實(shí)際樣品分析

采用本方法檢測(cè)牛奶及蜂蜜樣品。將純牛奶在室溫下以10000 r/min離心10 min，除去上層脂肪，然后加入一定濃度的卡那霉素進(jìn)行檢測(cè);取1 mL蜂蜜溶于9 mL去離子水中，加入一定濃度的卡那霉素進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。牛奶樣品的加標(biāo)回收率在97.3%～99.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在3.3%～5.0%之間;蜂蜜的加標(biāo)回收率在96.0%～105.0%之間，RSD在3.5%～4.8%之間，說(shuō)明本方法靈敏度較高，特異性較好，可用于牛奶和蜂蜜等實(shí)際樣品中卡那霉素殘留的檢測(cè)，實(shí)用性良好。

4?結(jié) 論

基于金納米粒子體系吸光度的變化和HCR構(gòu)建了適配體傳感器，用于卡那霉素的比色檢測(cè)。此策略無(wú)需標(biāo)記，無(wú)需酶的參與，不涉及復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)及變溫調(diào)控，即可實(shí)現(xiàn)卡那霉素的特異檢測(cè)，檢出限為0.9 nmol/L，并可用于實(shí)際樣品如牛奶和蜂蜜中的卡那霉素檢測(cè)。本方法操作簡(jiǎn)單便捷，適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景，對(duì)其它抗生素或目標(biāo)物檢測(cè)方法的建立具有參考價(jià)值。

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