李湘鑾，劉巧瑜，趙文紅，楊娟，白衛(wèi)東*，胡松青

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州，510225)2(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510640)3(廣州市廣式傳統(tǒng)食品加工與安全控制重點實驗室，廣東 廣州，510225)

鹵制品是我國特色加工肉制品，其消費呈現(xiàn)逐年增長的趨勢。鹵制品特征鮮明，具有濃郁的鹵汁香味、悠長的回味、軟爛的質地口感，常用作開胃菜、冷菜和即食休閑食品，深受廣大消費者的喜愛。牛肉是鹵制品加工常用的原料。

蛋白質是牛肉中最主要的成分，具有廣泛的功能特性，可形成網(wǎng)絡與結構，可與其它成分協(xié)同，在肉制品質地、滋味與營養(yǎng)品質的形成中發(fā)揮重要作用[1-3]。肌原纖維蛋白不僅對肉制品持水性具有重要的影響[4]，也和骨架蛋白決定肉的肌原纖維強度[5]。水是食品體系中最重要的成分，對食品的加工變化、產(chǎn)品品質和儲存穩(wěn)定性具有重要的影響[6]。牛肉中大部分水因毛細管的束縛存在于肌原纖維中。水的運動性對產(chǎn)品的穩(wěn)定性具有關鍵的影響。核磁共振(nuclear magnetic，NMR)是一種無損檢測方法，可用于分析水質子的運動性和分布[7-8]。

牛肉鹵制過程中，一方面蛋白質受熱變性，導致蛋白質-水相互作用的變化以及肌肉纖維橫縱向的收縮變化，使其水結合能力下降[9-10]，從而改變鹵牛肉質地特性和水分分布，有助于肉制品品質的形成。另一方面，蛋白質降解生成游離氨基酸和肽。這些降解產(chǎn)物是風味化合物的前體物質，對鹵牛肉的滋味具有一定影響[11]。蛋白質占鹵牛肉干重的55% 以上，但關于牛肉在鹵制過程中蛋白質組分的變化情況，以及是否影響鹵牛肉品質的研究較少，且作用機理尚不清楚。

為探討蛋白質在鹵牛肉滋味、水分分布和品質形成中的作用，本文研究了牛肉鹵制過程中蛋白質組分的變化，并分析其對鹵牛肉理化特性的影響，以期為優(yōu)化牛肉鹵制工藝提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛后腿肉：魯西黃牛(18月齡)，廣東清遠牧原養(yǎng)牛場。

NaCl、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、NaOH、三氯乙酸(TCA)、甲醇，均為分析純，國藥集團有限公司。

生姜、洋蔥、花椒、二鍋頭(酒精度為46%)、食鹽均為食品級，市購。

1.2 儀器與設備

Eppendorf 5418高速冷凍離心機，艾本德中國有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜，美國安捷倫科技有限公司；K9860型全自動凱式定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；TA-XTPlus質構儀，英國Stable Micro Systems公司;MesoMR23-040H-I核磁共振成像分析儀，蘇州紐邁分析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牛肉鹵制方法

將100 g生姜汁、100 g洋蔥汁、10 g花椒、200 g二鍋頭和300 g食鹽拌和均勻，制得腌制劑。牛肉切成10 cm×10 cm×3 cm的規(guī)格，用10%腌制劑(質量分數(shù))0～4 ℃腌制24 h，然后放入1.8倍體積的鹵汁中于95 ℃分別鹵制60、90、120、150和180min。

1.3.2 各蛋白質組分的分離提取與測定

參考VISESSANGUAN的方法[12]，并稍作修改。4.00 g樣品加入10倍體積的提取液A(15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.5)，9 500 r/min均質1 min，10 000 r/min離心20 min。上清液加入冷卻的50% TCA至最終濃度為10%，10 000 r/min離心15 min，上清液和沉淀分別為非蛋白氮和水溶蛋白。沉淀中加入10倍體積的提取液B(0.45 mmol/L KCl、15.6 mmol/L KH2PO4、3.5 mmol/L Na2HPO4，pH 7.5)，9 500 r/min均質1min，然后10 000 r/min離心15 min，重復離心2次。上清液為鹽溶蛋白。沉淀加入10倍體積0.1 mol/L NaOH，10 000 r/min離心15 min，所得上清液和最終的沉淀分別為堿溶蛋白和堿不溶蛋白。蛋白質含量測定采用凱氏定氮法(GB5009—2010)。

1.3.3 游離氨基酸分析方法

參照CEYLAN的方法并適當調整[13]，采用HPLC測定。精準稱取4.00 g樣品加入三氯乙酸40 mL，9 500 r/min勻質1 min，再用雙層濾紙過濾。濾液于4 ℃條件下10 000 r/min離心30 min，然后取1 μL上清液進樣分析。

HPLC測定條件：色譜柱為ODS HYPERSIL柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；采用鄰苯二甲醛和9-甲基氯甲酸酯進行柱前衍生化處理；流動相A：20 mmol/L醋酸-醋酸鈉溶液(pH 7.2)，流動相B：V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1。流動相流速1 mL/min，柱溫40℃。

1.3.4 水分含量測定

按照GB 5009.3—2016食品安全國家標準 食品中水分的測定中的直接干燥法[14]。

1.3.5 LF-NMR橫向弛豫時間(T2)測定

整塊樣品放入60 mm的檢測線圈內(nèi)在室溫下測定NMR弛豫時間波譜，采用CPMG序列采集。操作條件：TR=500 ms，NS=4，Echo Time=100 μs，Echo Count=2 500。數(shù)據(jù)采用PQ001軟件分析。

1.3.6 質構分析(TPA)

鹵牛肉自然冷卻至室溫，切成3 cm×3 cm×3 cm的方塊。采用TA-XTPlus質構儀測定樣品的質構。測定參數(shù)：探頭P5，測試前速度3 mm/s，測試后速度2 mm/s，測定間隔時間20 s，探頭距離20 mm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個試驗重復做3次，取3次平行測定的平均值，采用SPSS 11.0軟件分析數(shù)據(jù)間的顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 牛肉鹵制過程中蛋白質組分的變化

根據(jù)蛋白質溶解性的不同，牛肉中的蛋白質可分成NPN、水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、堿溶蛋白和堿不溶蛋白。NPN主要由氨基酸和肽組成。水溶蛋白主要由肌漿蛋白組成，包括磷酸化酶、肌酸激酶以及磷酸甘油激酶[15]。鹽溶蛋白主要由肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白等多種肌原纖維蛋白組成。堿溶蛋白主要包括變性的肌動球蛋白和膠原蛋白的降解物[16]。堿不溶蛋白由膠原蛋白和彈性蛋白等大分子質量基質蛋白組成。

如圖1所示，牛肉在鹵制過程中，NPN含量逐漸增大(P<0.05)。由于蛋白質降解產(chǎn)生肽和游離氨基酸，導致NPN含量增大。而水溶蛋白、鹽溶蛋白以及堿溶蛋白均顯著下降(P<0.05)，表明這部分蛋白質在熱的作用下大量降解并部分地溶于鹵汁中。堿溶蛋白是牛肉中的最主要蛋白質組分。鹽溶蛋白在加熱過程中部分舒張并形成網(wǎng)絡，部分親水性基團可能暴露于蛋白質的表面，從而提高牛肉的持水能力。蛋白質總量的下降是水溶蛋白、鹽溶蛋白和堿溶蛋白的共同下降的結果。堿不溶蛋白的含量高于其它蛋白質組分，且不溶于鹵汁，故其下降速率緩慢(P>0.05)。

圖1 牛肉鹵制過程中蛋白質組分的含量Fig.1 Contents of protein fractions during processing of beef marinating注：不同指標小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

2.2 牛肉鹵制過程中游離氨基酸的變化

鹵制過程中，游離氨基酸總量在60 min時顯著增大(P<0.05)，90 min時明顯減少(P<0.05)，隨后顯著增大(P<0.05)(表1)。游離氨基酸總量從2 677.4 mg/kg顯著增加到3 370.3 mg/kg，這是由于蛋白質的降解和鹵汁中的氨基酸擴散到牛肉中。

鹵牛肉滋味的鮮味程度與肌肉中呈味氨基酸的含量和組成有關[17]。鮮味氨基酸主要為谷氨酸和天冬氨酸。鹵制過程中，谷氨酸的含量明顯地連續(xù)增大(P<0.05)，由此導致游離氨基酸總量的增加。鹵牛肉中增加的谷氨酸主要來自于鹵汁中味精和醬油的添加，它們的主要成分為谷氨酸鈉。丙氨酸含量顯著地連續(xù)下降(P<0.05)，導致甜味氨基酸總量的下降。這表明大量的氨基酸溶于鹵汁中或降解。而苦味氨基酸總量變化不明顯，其中甲硫氨酸和半胱氨酸是肉味風味的前提物質，在鹵制過程中經(jīng)Strecher降解生成不同的含硫化合物，從而產(chǎn)生含硫的揮發(fā)性前體物質。因此鹵制過程中谷氨酸和游離氨基酸總量的增加有助于鹵牛肉滋味的形成。

游離氨基酸的相互作用有助于形成肉品特有的滋味[18-19]。纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸可明顯加強滋味的強度[20-21]。游離的賴氨酸、酪氨酸和天冬氨酸與肉的老化滋味具有明顯關系[22]。

表1 牛肉鹵制過程中游離氨基酸的含量 單位：mg/kgTable 1 The content of free amino acids during processing of beef marinating

注：同一行中上標字母不同表示彼此間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 牛肉鹵制過程中水分含量的變化

鹵制過程中，牛肉中的水分含量呈逐漸下降趨勢(P<0.05)(表2)。牛肉中的大部分水因毛細管的束縛存在于肌纖維中。熱誘導的蛋白質的變性和結構性收縮降低蛋白質的持水能力。肌球蛋白約占肌原纖維蛋白總量45%，是熱穩(wěn)定性最低的結構蛋白，在 40～60 ℃便開始變性[23]。蛋白質含量的變化(圖1)顯示，鹵制過程中牛肉中的蛋白質逐漸變性、降解、溶于鹵汁中，導致牛肉中的水分大量析出。

表2 牛肉鹵制過程中水分含量的變化Table 2 The change of moisture content during processing of beef marinating

2.4 牛肉鹵制過程中水分分布的變化

2.4.1 牛肉鹵制過程中橫向弛豫時間T2的變化

根據(jù)水分存在的狀態(tài)，依次可分為結合水(T21)、不易流動水(T22)和自由水(T23)。如圖2所示，未鹵制牛肉的圖譜中只有2個峰，鹵牛肉的圖譜中出現(xiàn)3個峰，表明未鹵制牛肉中水分的存在狀態(tài)不同于鹵牛肉的。T22信號強度和峰面積最大，說明牛肉中的水分主要為不易流動水。

圖2 牛肉鹵制過程中弛豫時間T2分布圖Fig.2 Distribution of transverse relation time T2 during processing of beef marinating

橫向弛豫時間T2可以反映水分的自由度，T2越大，水分自由度越大。如表3所示，牛肉鹵制過程中，T21的弛豫時間無明顯差別(P<0.05)，說明這部分結合水很穩(wěn)定，不受蛋白質降解的影響。T22在初始的90 min顯著地下降(P<0.05)，隨后保持不變。鹵制過程中，一方面鹽溶蛋白部分舒張并形成網(wǎng)絡，部分親水性基團暴露于蛋白質的表面，從而降低不易流動水的自由度。另一方面因蛋白質的降解，肽和氨基酸濃度增大，由此提高了細胞內(nèi)滲透壓，增強牛肉的持水能力。T23在60～90 min與120～180 min均保持不變，但隨著鹵制時間的增加，自由水的水分活度增強 (P<0.05)。自由水主要存在于毛細管中。重建的蛋白質網(wǎng)絡形成新的毛細管，部分不易流動水轉變成自由水并存在于新產(chǎn)生的毛細管中，導致蛋白質持水能力的下降。鮮牛肉中未檢測出自由水，這是由于為去除牛肉中的血水，牛肉鹵制前進行出水處理。出水過程中，由于蛋白質的變性及結構收縮，牛肉中的自由水完全析出。

表3 牛肉鹵制過程中橫向弛豫時間T2Table 3 Transverse relaxation times T2 during processing of beef marinating

注：ND表示未檢出；同一列中上標字母不同表示彼此間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4.2 牛肉鹵制過程中水分分布的變化

根據(jù)峰面積變化可以得到鹵制過程中不同狀態(tài)水分含量及遷移情況[24]。牛肉中水的總峰面積連續(xù)地顯著變小(P<0.05)，這與T22峰面積的變化趨勢一致(表4)。不易流動水占牛肉中總水分含量的90%，所以總峰面積受T22峰面積的影響。鹵牛肉中結合水T21的峰面積明顯地高于未鹵制牛肉的(P<0.05)，鹵牛肉間結合水的峰面積幾乎無差異(P>0.05)。因蛋白質水解而新暴露的親水基團與新產(chǎn)生的肽促進蛋白質的水化作用[24]，導致牛肉中結合水的含量增大。T22的峰面積逐漸下降(P<0.05)，由于不易流動水存在肌原纖維內(nèi)，牛肉中肌纖維蛋白在40～75 ℃時開始變性，熱收縮導致肌纖維間距的減少，導致不易流動水含量下降，蛋白質持水能力的下降。T23的峰面積明顯地波動(P<0.05)，150 min時達到最大值。不同狀態(tài)的水的比例因蛋白質數(shù)量與性質的不同而不同，導致鹵制過程中牛肉中結合水、不易流動水和自由水的相對含量出現(xiàn)不規(guī)則變化，以及相對含量的變化趨勢有別于峰面積的變化。

2.5 牛肉鹵制過程中質構的變化

質構是表征牛肉的嫩度指標之一。如表4所示，鹵制過程中牛肉的剪切力和硬度逐漸減小且差異顯著(P<0.05)，說明牛肉的嫩度越高。加熱使膠原蛋白的溶解度增大，肌束膜的膠原纖維受熱發(fā)生變性，破壞肌束膜結構的完整性，結締組織被破壞，從而提高牛肉的嫩度。牛肉的黏性顯著性下降(P<0.05)。牛肉的黏性與強度隨著肌原纖維蛋白含量的降低而下降。牛肉的彈性和黏聚性略降低(P>0.05)。牛肉蛋白質組分變化顯著影響肉的質地。牛肉中結構性蛋白主要為膠原蛋白、肌原纖維蛋白和肌球蛋白，蛋白質的熱變性和降解改變其結構，從而降低肌纖維的機械強度和的凝膠能力，導致肉的剪切力、硬度、黏性和黏聚性下降[25]。這些變化也形成鹵牛肉軟爛質地口感。

表4 鹵制過程中牛肉水分的分布(mean±SD，n=3)Table 4 Corresponding relative populations during processing of beef marinating

表5 牛肉鹵制過程中質構變化Table 5 Change of texture during processing of beef marinating

注：同一列中上標字母不同表示彼此間差異顯著(P<0.05)

3 結論

蛋白質的變性及降解使其含量與持水能力的下降，導致鹵制過程中牛肉中大量的水分析出到鹵汁中(P<0.05)。牛肉在鹵制過程中，NPN含量逐漸增大(P<0.05)，而水溶蛋白、鹽溶蛋白、堿溶蛋白及蛋白總量均顯著下降，與蛋白質在熱的作用下大量降解產(chǎn)生肽和游離氨基酸并部分地溶于鹵汁中有關。鹵汁中的谷氨酸大量擴散到牛肉中導致鹵牛肉中谷氨酸含量及游離氨基酸總量的顯著增大(P<0.05)。鹵制過程中，牛肉中的水分含量逐漸下降(P<0.05)。水分以結合水、不易流動水和自由水的狀態(tài)在鹵牛肉均勻分布，不易流動的水分自由度明顯高于結合水的(P<0.05)。鹵制過程中結合水緩慢下降(P>0.05)；不易流動水的含量快速下降(P<0.05)，自由水的含量明顯地波動(P<0.05)。鹵制后，牛肉的剪切力、硬度、黏性均明顯下降(P<0.05)，彈性和黏聚性均略下降(p>0.05)。這些變化促進鹵制過程中鹵牛肉滋味、質地特征的形成。