曾蘭君,包曉瑋,趙紫葉,段麗娟,鄒楠

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)

近年來由于細(xì)菌耐藥性問題及食品加工中化學(xué)防腐劑的使用嚴(yán)重危害了人類的生命健康，研究發(fā)現(xiàn)，一些天然植物具有抗菌譜廣、毒性小、來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，為研究和開發(fā)安全、高效的天然食品防腐劑提供了新的思路[1]。

刺山柑(CapparisspinosaL.)為白花菜科山柑屬植物，又名老鼠瓜、槌果藤，俗稱野西瓜[2-4]。國外主要分布于亞洲西部、歐洲、北美和大洋洲[5]，我國主要分布于新疆、西藏、甘肅等地的荒漠及干旱地區(qū)。在新疆地區(qū)，刺山柑作為傳統(tǒng)的民族藥物，其藥用歷史悠久，民間常將其鮮果搗碎敷于患處，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)[6-8]等?，F(xiàn)代研究表明，刺山柑活性部位中主要含有吲哚類、黃酮類、酚酸類等化學(xué)成分[9]，具有抗炎[10-12]、抗氧化[13]、抗菌[14-16]、降血糖[17]、降血脂[18]、保肝[19]等作用。在抑菌活性方面，徐琦[14]通過實(shí)驗(yàn)證明了，刺山柑乙酸乙酯萃取物對大腸桿菌具有顯著的抑制作用；MAHASNEH[15]對刺山柑95%乙醇提取物進(jìn)行了抗菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乙醇提取物對革蘭氏陽性菌和真菌有一定的抑制作用。ALI-SHTAYE等[16]研究發(fā)現(xiàn)刺山柑水提液可完全抑制2種表皮真菌的生長。可見刺山柑作為天然食品防腐劑具有潛在的開發(fā)價(jià)值，目前對刺山柑萃取物的抑菌穩(wěn)定性的研究還未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)對刺山柑4種萃取物體外抑菌活性進(jìn)行探討，并考察溫度、紫外光照、pH對刺山柑乙酸乙酯及正丁醇萃取物的影響，以期為將刺山柑開發(fā)成天然的食品防腐劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺山柑：新疆吐魯番野生果實(shí)。

供試菌種：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

試劑：蛋白胨、酵母浸粉、NaCl和瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙醇、二甲基亞砜、石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204-IC型電子天平，梅特勒-托多利儀器有限公司；XL-02A粉碎機(jī)，燁昌機(jī)械有限公司；JBT/C-YCL400T/3P(D)超聲波藥品處理機(jī)，濟(jì)寧金佰特工程機(jī)械有限公司；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DSX-280KB24手提式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；JQ000453無菌操作臺，蘇凈集團(tuán)安泰公司制造；THZ-82A氣浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺山柑萃取物的制備

參照任遠(yuǎn)[20]方法并稍作修改，取刺山柑干燥果實(shí)200 g，粉碎成粗粉，以1∶10(g∶mL)的料液比，分別用體積分?jǐn)?shù)的80%及50%乙醇各超聲提取2次，提取時(shí)間50 min，將乙醇提取液合并，55 ℃條件下減壓濃縮至膏狀，得乙醇提取物，將其混懸于等量的蒸餾水中，然后按照1∶2的體積比，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇溶劑(溶劑極性由小至大)對乙醇提取物進(jìn)行分級萃取，各極性溶劑于室溫下重復(fù)萃取4次，分別收集萃取液，55 ℃條件下減壓濃縮至10 mL，于通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行風(fēng)干，得到4種刺山柑萃取物。實(shí)驗(yàn)前用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)將4種萃取物溶解，4 ℃冷藏備用。

1.3.2 培養(yǎng)基的配置

LB液體和固體培養(yǎng)基配置參考綦國紅等[21]方法。

1.3.3 菌種的活化與菌懸液制備

分別挑取3種供試菌株的單個(gè)菌落于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，置于37 ℃恒溫振蕩器振蕩培養(yǎng)18～24 h，用滅菌生理鹽水將活化好的供試菌株稀釋成濃度為106～107CFU/mL的菌懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 瓊脂打孔法測定抑菌圈直徑的大小

參照李敏[22]方法并稍作修改，分別取已定量稀釋的3種供試菌種菌懸液，置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，倒入50 ℃左右融化后的LB固體培養(yǎng)基，厚度3～5 mm，輕輕搖晃均勻，待其冷卻凝固后，用6 mm滅菌金屬打孔器在平板內(nèi)等距打4個(gè)孔，挑出孔內(nèi)的瓊脂，向每孔中分別加入50 μL質(zhì)量濃度為200 mg/mL刺山柑4種萃取物藥液及對照品溶液(DMSO)，然后將各培養(yǎng)皿放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18～24 h，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑的大小。抑菌圈直徑取3個(gè)平行孔的平均值為測定結(jié)果。

1.3.5 最小抑菌濃度測定(minimal inhibitory concentration，MIC)

采用試管二倍稀釋法將刺山柑4種溶劑萃取物分別配制為200、100、50、25、12.5、6.25 mg/mL的樣品溶液，參照吳永祥等[23]及王建軍等[24]方法。結(jié)果以肉眼無可見菌落生長的最小質(zhì)量濃度為其MIC。

1.4 刺山柑萃取物的抑菌穩(wěn)定性[25-27]

分別測定不同溫度、紫外光照時(shí)間、pH值對刺山柑萃取物樣品溶液抑菌活性穩(wěn)定性。以打孔法測定樣品溶液對3種供試菌種的抑菌圈直徑。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 19.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，利用Duncan’s多重比較法分析樣本間的差異顯著性，圖表采用origin 8.5繪制，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺山柑萃取物對3種供試菌的抑菌活性

由圖1及表1可知，刺山柑4種溶劑萃取物在相同濃度下，對3種供試菌種均有一定的抑制作用。對枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制作用以乙酸乙酯萃取物活性最佳，對大腸桿菌的抑制作用以正丁醇萃取物活性最佳，徐琦[14]研究得出，大腸桿菌對刺山柑乙酸乙酯萃取物較乙醇提取物、石油醚、正丁醇萃取物更為敏感，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所差異，可能由于提取方式的不同，導(dǎo)致抑菌成分在各萃取物中分布不同，因而表現(xiàn)出不同的抑菌效果。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刺山柑4種溶劑萃取物對革蘭氏陽性菌的抑菌效果強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，由于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁由外膜和周質(zhì)間隙組成，外膜由脂多糖、磷脂、蛋白質(zhì)和脂蛋白等復(fù)合構(gòu)成，周質(zhì)間隙是一層薄的肽聚糖。外膜的存在構(gòu)成了不對稱的膜結(jié)構(gòu)，因此形成了對親水性及疏水性物質(zhì)的滲透屏障[28]，影響了抑菌效果。

A-枯草芽孢桿菌;B-金黃色葡萄球菌;C-大腸桿菌圖1 刺山柑4種萃取物對3種供試菌抑菌圈直徑大小Fig.1 Diameter of bacteriostasis circle of four extracts from Capparis spinosa L. against three species

表1 刺山柑萃取物的抑菌效果Table 1 The bacteriostatic effect of different polar solvent extracts from Capparis spinosa L.

注：-表示抑菌圈直徑為0

2.2 刺山柑萃取物最小抑菌濃度(MIC)的測定

由于最小抑菌濃度(MIC)可作為評價(jià)抑菌物質(zhì)體外抑菌活性強(qiáng)弱的指標(biāo)，其值越小，表明該樣品對受試菌種的抑制作用越強(qiáng)。如表2所示，刺山柑乙酸乙酯、正丁醇萃取物對3種供試菌的抑菌效果更好，其中對枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)，MIC為6.25 mg/mL；其次為金黃色葡萄球菌，MIC為25 mg/mL；而對大腸桿菌，正丁醇萃取物具有較好的抑菌效果，MIC為25 mg/mL。因此，為了充分研究刺山柑萃取物的抑菌效果，本實(shí)驗(yàn)篩選刺山柑乙酸乙酯和正丁醇萃取物進(jìn)行后續(xù)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 刺山柑萃取物的抑菌穩(wěn)定性研究

2.3.1 不同溫度對刺山柑萃取物抑菌活性的影響

由圖2可知，隨著溫度逐漸升高，刺山柑乙酸乙酯萃取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑差異均不顯著(P<0.05)；對大腸桿菌抑菌圈直徑在121 ℃時(shí)最大，與20 ℃相比差異顯著(P<0.05)，說明乙酸乙酯萃取物具有較好的熱穩(wěn)定性，周怡等[27]研究發(fā)現(xiàn)，勝紅薊提取物在100 ℃抑菌圈直徑最好為(12.37±0.71) mm，4 ℃時(shí)抑菌圈直徑最小為(11.24±0.18)mm，二者相比差異顯著(P<0.05)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，具體原因有待進(jìn)一步研究。刺山柑正丁醇萃取物對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑在121℃時(shí)最小，與100 ℃以下相比差異顯著(P<0.05)；對金黃色葡萄抑菌圈直徑在20～60 ℃逐漸增大，在60 ℃時(shí)抑菌圈直徑最大，60～121 ℃逐漸減小，121 ℃時(shí)抑菌圈直徑與20 ℃空白對照組相比差異不顯著(P<0.05)，說明在一定溫度范圍內(nèi)，可以促進(jìn)正丁醇萃取物的抑菌活性。

表2 刺山柑萃取物對3種供試菌的MICTable 2 MIC of Capparis spinosa L. extracts against three tested bacteria

A-刺山柑乙酸乙酯萃取物；B-刺山柑正丁醇萃取物圖2 不同溫度對刺山柑萃取物抑菌效果的影響Fig.2 Effect of different temperatures on bacteriostatic activity of extracts from Capparis spinosa L.注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(下同)

2.3.2 不同紫外光照射時(shí)間對刺山柑萃取物抑菌活性的影響

由圖3可知，在經(jīng)過不同時(shí)間紫外光照射之后，刺山柑乙酸乙酯萃取物對枯草芽孢抑菌圈直徑差異不顯著(P<0.05)；對金黃色葡萄球抑菌圈直徑與空白對照組相比差異均不顯著(P<0.05)；對大腸桿菌抑菌圈直徑在0～25 min先增大后減小；刺山柑正丁醇萃取物對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑在10～25 min先減小后增大；對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑在0～10 min時(shí)減小，10～15 min增大，15～20 min時(shí)減小，20～25 min增大；對大腸桿菌的抑菌圈直徑在10～15 min時(shí)增大，15～30 min時(shí)與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)。由此可見，刺山柑乙酸乙酯、正丁醇萃取物中某些抑菌活性成分對紫外光照較為敏感。于洋[29]、任遠(yuǎn)[20]從乙酸乙酯萃取物中分離出9種單體化合物，包括5種酚酸類化合物，如香草酸、對羥基苯甲酸、原兒茶酸等，可能是由于萃取物中的這些酚類物質(zhì)見光易分解，使其抑菌活性減弱。

A-刺山柑乙酸乙酯萃取物；B-刺山柑正丁醇萃取物圖3 不同紫外光照射時(shí)間對刺山柑萃取物抑菌效果的影響Fig.3 Effect of different ultraviolet irradiation time on the bacteriostatic effect of extracts from Capparis spinosa L.

2.3.3 不同pH對刺山柑萃取物抑菌活性的影響

由圖4可知，在經(jīng)過酸堿處理后，刺山柑乙酸乙酯萃取物對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑在pH=3～5時(shí)減小，pH=5～7時(shí)增大，pH=7～11時(shí)急劇減小，當(dāng)pH=7(空白對照組)時(shí)，未經(jīng)酸堿處理的刺山柑乙酸乙酯萃取物對枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑與其他pH相比差異顯著(P<0.05)；對大腸桿菌抑菌圈直徑pH=3時(shí)，與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)；刺山柑正丁醇萃取物對枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑在pH=9～11時(shí)減??；對金黃色葡萄球菌在pH=5～11時(shí)逐漸減??；對大腸桿菌在pH=9～11時(shí)喪失了抑菌活性。綜上所述，乙酸乙酯和正丁醇萃取物對pH不穩(wěn)定，可能是由于萃取物中的某些酚酸類物質(zhì)在自然情況下呈酸性，pH的降低能引起其所帶酚羥基電離度變小，疏水性增強(qiáng)，使其抑菌效果增強(qiáng)，而在堿性環(huán)境下萃取物中的酚酸類物質(zhì)會發(fā)生水解生成醌類，從而引起抑菌活性能力的減弱[30]。

A-刺山柑乙酸乙酯萃取物；B-刺山柑正丁醇萃取物圖4 不同pH對刺山柑萃取物抑菌效果的影響Fig.4 Effect of different pH on antibacterial activity of extracts from Capparis spinosa L.

3 結(jié)論

本文對比了刺山柑4種不同極性溶劑萃取物的抑菌活性并模擬了食品體系中主要因素對萃取物抑菌活性的影響，通過對抑菌圈直徑及最小抑菌濃度的測定，得出抑菌活性主要集中在乙酸乙酯及正丁醇萃取物中；乙酸乙酯及正丁醇萃取物對溫度、紫外光照射、pH不穩(wěn)定，但在一定范圍內(nèi)，有助于促進(jìn)萃取物的抑菌活性。本研究為刺山柑萃取物應(yīng)用于食品防腐、抑菌提供了理論依據(jù)，但對刺山柑萃取物中有效抑菌成分的明確、抑菌機(jī)理及毒理學(xué)評價(jià)等方面還有待進(jìn)一步研究。