陳燕蘭，鐘淳菲，徐雅囡，杜冰，任運紅，黎攀

(華南農業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州，510000)

鐵皮石斛(Dendrobium officinale)，屬被子植物門，單子葉植物綱，蘭科，石斛屬。鐵皮石斛不僅含有多糖、生物堿、糖苷類、氨基酸類以及微量元素等多種成分[1-2]，還具有多種藥理作用，如增強機體的免疫能力[3]、抗氧化[4]、抗衰老[5]、抗腫瘤[6-8]和降低血糖等[9-10]，因此在民間有“救命仙草”、“中華仙草”的美稱。

目前，國內外對不同部位、不同生長期、不同培養(yǎng)方式和不同干燥方式的鐵皮石斛進行了大量的研究，曹雪原等[11]測定了鐵皮石斛莖、葉、花中的多糖含量,發(fā)現莖中的多糖含量最高。徐云燕等[12]比較了人工培植的不同生長期的鐵皮石斛中生物堿和多糖的含量，結果發(fā)現鐵皮石斛三年生的多糖含量和總生物堿含量最高。冷佳奕[13]研究了不同培養(yǎng)方式對鐵皮石斛類原球莖有效成分的影響，得出液體靜置培養(yǎng)的鐵皮石斛類原球莖比固體培養(yǎng)增殖更為迅速，也更適宜于總生物堿和多糖的積累。辛明等[14]發(fā)現經不同干燥工藝處理鐵皮石斛后，其多糖含量大小排列為熱風干燥>真空干燥>真空冷凍干燥>自然晾干。但有關不同地區(qū)鐵皮石斛的品質差異的研究較少，且主要是研究了云南省和浙江省地區(qū)的鐵皮石斛，如仝晶晶等[15]分析研究了6個不同產地鐵皮石斛功效成分，發(fā)現浙江省樂清市雙峰鄉(xiāng)所產石斛的多種功效成分相對較高。劉文杰等[16]對云南省不同產地鐵皮石斛的主要化學成分進行分析，發(fā)現勐海地區(qū)的鐵皮石斛質量最好。而本文通過測定鐵皮石斛的多糖、生物堿、黃酮等活性成分含量、多糖分子質量以及硬度、剪切力、剪切位移、黏稠度、色澤等物性，研究了廣東、浙江、湖南以及云南地區(qū)的鐵皮石斛的品質，能更進一步地反映不同地區(qū)鐵皮石斛的品質差異，不僅可以為日后鐵皮石斛的種植指明方向，節(jié)省勞動力和科技力量，而且為鐵皮石斛進一步開發(fā)利用以及石斛行業(yè)的質量規(guī)范提供試驗數據支撐。

該研究在前期采集樣品時，基于每個省的鐵皮石斛的種植面積和主要的種植基地以及各地區(qū)的全年氣候等原因，主要選取了廣東、浙江、湖南以及云南地區(qū)的鐵皮石斛進行研究。在以上地區(qū)選取了7個鐵皮石斛的主要產地進行采集，并且分別在每個采集地釆集了6份不同的樣品，以保證釆集的樣品量充裕，防止由于樣品的個體差異對實驗結果造成影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7個地區(qū)的鐵皮石斛(具體如表1)，無限極(中國)有限公司研發(fā)中心；無水葡萄糖對照品、甘露糖對照品(分析純)，上海士鋒科技有限公司；石斛堿對照品、蘆丁對照品(分析純)，廣州市齊云生物技術有限公司；乙腈、苯酚、甲醇、乙酸銨、三氯甲烷、酚酞、NaOH、HCl、NaNO2(分析純)，廣州化學試劑廠；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(分析純)，上海酶聯檢測技術有限公司。

表1 石斛樣品的種類、批號、年齡、栽培方式及產地Table 1 Species, batch number and producing area of Dendrobium samples

1.2 儀器與設備

SC-80C全自動色差儀，北京康光儀器廠；EZ-Test質構儀、LC-20A液相色譜儀、RID-10A示差折光檢測器，日本(島津)有限公司；UV5100紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)器鞏義市予華儀器有限責任公司；MAT 95XP Thermo型質譜儀，Thermo公司；Krromacil C18制備色譜柱美國Krromacil公司；TSKgel G5000PWxl凝膠柱、TSKgel G3000PWxl凝膠柱，東曹達(上海)貿易有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 活性成分含量測定

1.3.1.1 多糖的測定

參照2010版《中國藥典》中的實驗方法測定鐵皮石斛的多糖含量。

1.3.1.2 多糖的單糖組分分析

參考陳欣等[17]的方法。采用水提醇沉法提取鐵皮石斛多糖，后經葡聚糖凝膠色譜柱法純化。純化后的多糖再經過乙?；?，參考陳乃東等[18]的分析條件，進行GC-MS氣相色譜-質譜聯用儀分析，并用GC-MS面積歸一化法算出單糖組成含量以及甘露糖與葡萄糖峰面積之比。

1.3.1.3 甘露糖含量的測定

參照2010版《中國藥典》測定鐵皮石斛的甘露糖含量的方法。

1.3.1.4 浸出物含量的測定

參照2010版《中國藥典》中“熱浸法測定水醇溶性浸出物”的方法測定鐵皮石斛的水醇溶性物質。

1.3.1.5 可溶性固形物含量

參考劉俊等[19]的方法，稱取一定質量的石斛樣品，100 ℃復水5 min，取出瀝干后加水打漿(料液比為1∶20)后，滴1滴石斛漿狀液于糖度計上測定其固形物含量。

1.3.1.6 黃酮類物質的測定

參考房曉亮等[20]的方法并做一定的修改，用80%乙醇配制0.2 mg/mL的蘆丁對照品標準液，按照方法繪制標準曲線。準確稱取2.0 g石斛干粉(60目篩)，置于索氏提取器中，加入80%乙醇120 mL回流提取1 h，過濾。最后用80%乙醇定容至250 mL。精確吸取樣品溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，按照標準曲線項下操作，每個樣品平行測定3次，測得的吸光度代入蘆丁標準曲線方程中，計算石斛中總黃酮的含量。

1.3.1.7 生物堿含量的測定

使用酸性染料比色法[21]測定石斛中生物堿的含量。

1.3.1.8 多糖分子質量的測定

采用高效凝膠滲透色譜法測定，其色譜柱為TSKgel G5000PWxl與G3000PWxl(7.8 mm × 30 cm，Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)串聯使用，最大壓力設置為3 MPa，流動相為20 mmol/L磷酸緩沖液，pH 為7.0，進樣量是20 μL，流速為0.5 mL/min，洗脫時間80 min。取葡萄糖和不同分子質量的右旋糖酐標準品(Dextran)用磷酸緩沖液制成10 mg/mL的溶液。取標準品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以保留時間為橫坐標，相對分子質量對數值為縱坐標，繪制標準曲線。用ddH2O將石斛多糖樣品溶液溶解成10 mg/mL溶液，過0.45 μm尼龍膜，再注入色譜儀，記錄色譜圖。根據樣品的保留時間，與標準曲線對照，用GPC軟件計算出多糖分子的分子質量。

1.3.2 鐵皮石斛的物性測定

1.3.2.1 硬度、剪切力和剪切位移的測定

將鐵皮石斛統(tǒng)一進行干燥處理，并測定其水分含量，當石斛干品水分含量相近時進行硬度和剪切力、剪切位移的測定。選取石斛相同部位，采用EZ-Test質構儀測定其硬度,使用ALKB切刀對樣品進行TPA測試,每個樣品重復10次。

1.3.2.2 黏稠度的測定

稱取一定質量的石斛樣品，100 ℃復水5 min，取出瀝干后加水打漿，料液比為1∶20(g∶mL)。分別精密稱取相同質量的石斛漿樣品置于高度50 cm，直徑8.0 cm的待測玻璃杯中，采用EZ-Test質構儀測定其黏稠度，每個樣品重復6次。

1.3.2.3 色差

參考楊曉娜[22]的方法，將不同石斛漿樣品分別平鋪于帶蓋的透明塑料皿中，壓實后采用色差儀測定色度值L*、a*、b*，每個樣品測量 3 次取平均值，并按公式(1)計算樣品與對照品(新鮮樣品)之間的總色差(ΔE)。

ΔE=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2

(1)

1.3.3 感官評價

參照2010版《中國藥典》中對鐵皮石斛品質的形態(tài)學和品質描述的方法，以及鐵皮石斛保健和食用中常取用的評價指標進行分級鑒定。為使評價直觀可靠, 隨機選取20～60歲不同年齡段的男女各20人，按照表2中的感官評價標準對7個地區(qū)的鐵皮石斛進行感官評價，采用每種評價標準量化打分的方式, 統(tǒng)計所得評價的平均值。

表2 石斛漿樣品的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria for Dendrobium samples

1.4 數據分析

利用 Excel 2007 軟件對數據進行統(tǒng)計；采用SPSS 16.0軟件Analyze模塊下的功能進行方差分析和相關性分析，數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛的物性分析

2.1.1 鐵皮石斛的水分含量和質構分析

表3為鐵皮石斛干品的水分含量及質構的測定結果，2010版《中國藥典》規(guī)定，鐵皮石斛干品水分含量不得超過12%。由表3可以看出，鐵皮石斛干品水分含量均為8.51%～9.69%，因此本試驗測試樣品符合規(guī)定。且各種鐵皮石斛干品中的水分含量沒有顯著性差異，可排除其對石斛硬度、剪切力和剪切位移的影響。

由表4鐵皮石斛產地與各種指標的相關性分析可以得出，不同產地對鐵皮石斛的硬度、剪切力、剪切位移、黏度以及稠度具有極顯著影響(P<0.01)。其中，S6的硬度和剪切力最大，S1的剪切力最小，S5的硬度最小但黏度稠度最大。硬度主要反映了樣品對變形抵抗的性質[23]。剪切力和剪切位移表示組織的脆性或彈性，剪切力和剪切位移越小，說明組織越脆，越容易切割[24]。傳統(tǒng)醫(yī)學認為，石斛黏稠度越高質量越好，因為黏液質含量就越高(大多數為水溶性多糖)[25]。所以S6的組織難以切割，抗變形能力最強，而S5的抗變形能力最弱，但因黏度稠度最大，質量可能比較好。其中S1的剪切力最小，但硬度比S5大，可能是因為S5是容易發(fā)生形變的物料，它需要將一部分剪切力用來克服壓縮時發(fā)生的形變，所以所需的剪切力增大[26]。由以上結論得知，以鐵皮石斛的質構特性為指標，云南玉溪容易加工且質量可能比較好；而湖南龍石山的黏度也高，但其硬度大，難以加工。

表3 鐵皮石斛干品的水分含量及質構的測定結果Table 3 The moisture content and texture of Dendrobium officinalis were determined

表4 鐵皮石斛產地與各種指標的相關性分析Table 4 Correlation analysis of Dendrobium officinalis habitats and various indexes

注：**為在0.01 水平上極顯著相關；*為在0.05 水平上顯著相關(下同)

2.1.2 復水鐵皮石斛打漿后的色差分析

由表5可知，S1的偏紅程度最大，S5的偏黃和偏綠程度最大。以產自廣東高要的鐵皮石斛漿S1為對照品，不同產地的鐵皮石斛漿的色差ΔE均大于6且差值較大，說明不同產地的鐵皮石斛漿均與廣東高要的鐵皮石斛漿的顏色有極顯著性差異。由此可見，不同地區(qū)的鐵皮石斛的顏色差異較大。

表5 不同石斛樣品的打漿后的色差值及相關性分析Table 5 Color difference and correlation analysis of different Dendrobium samples after pulping

注：a值表示樣品偏紅或偏綠程度，a值為正值時表示樣品偏紅，且a值越大樣品越紅，a值為負值則表示樣品偏綠；b值表示樣品偏黃或偏藍程度，正值表示偏黃，負值表示偏藍；L值表示樣品的亮度，L值越大說明樣品的亮度越大

2.1.3 復水石斛打漿后的感官品質評價

由表6可以看出，除了S4和S5稍帶異味，其他地區(qū)的鐵皮石斛都帶有輕微的草木香氣，其中S2的香氣值最高。此外，只有S2的味道帶有輕微甘甜，其他地區(qū)的鐵皮石斛味道一般甚至帶有苦味?？傮w而言，除了云南保山龍陵縣和云南玉溪的鐵皮石斛感官品質較差外，其他地區(qū)的鐵皮石斛的感官品質都在可接受范圍內，而且浙江臺州黃巖區(qū)的鐵皮石斛感官評價總分接近12分。

2.2 鐵皮石斛理化性質及活性物質含量分析

表7為石斛的活性物質含量測定結果。由表7可以看出，7個產地的鐵皮石斛的多糖含量差異較大，湖南龍石山的多糖含量最高，高達28.96%。而云南玉溪的多糖含量最低，為13.13%。其中鐵皮石斛的甘露糖含量隨多糖含量變化而變化，7個產地的鐵皮石斛的甘露糖含量差異也較大，湖南龍石山的甘露糖含量最高，高達14.35%。而云南玉溪的甘露糖含量最低，為5.83%。2010版藥典規(guī)定：鐵皮石斛按干燥品計算，多糖以無水葡萄糖 (C6H12O6)計，不得少于25.0%，鐵皮石斛干燥品的甘露糖含量應為13%～38%。結果顯示，只有湖南龍石山的鐵皮石斛達到了藥典要求，這說明地區(qū)會影響鐵皮石斛的多糖含及甘露糖含量。XU等[27]和MENG等也證實了鐵皮石斛在不同的栽培環(huán)境和不同產地種植下，其多糖含量的差異較大[27-28]。

表6 石斛漿樣品的感官評價Table 6 Sensory evaluation of Dendrobium sample

水溶性浸出物測定可充分反應藥材的內在質量，是確保其療效確切、質量可靠的有效手段。中藥材的浸出物含量測定作為控制其質量標準已經得到廣泛應用[29-31]。在這7個地區(qū)中，S4的水溶性浸出物含量最高，說明云南保山龍陵的鐵皮石斛的內在質量最好。不同產地的鐵皮石斛可溶性固形物含量也有所差異，其從大到小為S1>S5>S2>S6>S4>S3>S7；可得出廣東高要和云南玉溪的可溶性固形物最高，則兩者的可溶性糖、酸、維生素以及礦物質的含量最高，尤其是可溶性糖類含量。本試驗測定的產自浙江省的鐵皮石斛的黃酮含量與吳佳雯等[32]所測定的浙江省樂清市3個不同基地2年生鐵皮石斛莖中的黃酮含量相近；而產自云南玉溪鐵皮石斛的黃酮含量卻高于唐麗等[33]所研究的云南玉溪不同生長年齡的鐵皮石斛莖中的黃酮含量，這可能與鐵皮石斛的生長年齡有關，因為不同生長年齡的鐵皮石斛中黃酮含量差異明顯。

由以上的結論和表8鐵皮石斛產地與活性物質含量的相關性分析得出，不同產地對鐵皮石斛的多糖含量、水溶性浸出物含量、醇溶性浸出物含量、可溶性固形物含量、黃酮含量以及生物堿含量具有極顯著影響(P<0.01)。

表7 石斛的活性物質含量測定結果Table 7 Results of determination of active substances in Dendrobium

表8 鐵皮石斛產地與活性物質含量的相關性分析Table 8 Correlation analysis of Dendrobium officinalis in producing area and active substance content

2.3 多糖分子質量及其單糖組成

由表9可知，7種鐵皮石斛樣品多糖分子質量及其分布有明顯的差異。多糖的重均分子質量在5.177～1 996.597 kDa。其中產自湖南龍石山的鐵皮石斛S6的重均分子質量最大，為1 996.597 kDa，其次分別為S2、S3、S4、S5、S7、S1。多糖分子質量的分布系數為1.11～7.92，說明鐵皮石斛的多糖非均一組分，是雜多糖。

表10為鐵皮石斛多糖的單糖組成及其含量，由表可知，7種石斛樣品的單糖組成相近，都是一種酸性雜多糖，主要由4種六碳糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖)和3種五碳糖(核糖、阿拉伯糖、木糖)組成，其中甘露糖和葡萄糖含量最高。但不同產地的鐵皮石斛的單糖組成含量存在差異，7個地區(qū)中S4的甘露糖和葡萄糖含量最高，而S2的甘露糖和葡萄糖含量最低。XING等[34]也證實了鐵皮石斛多糖的單糖主要成分是甘露糖和葡萄糖。

表9 鐵皮石斛多糖平均分子質量及分布情況Table 9 Average molecular weight and distribution of polysaccharide of Dendrobium officinalis

表10 鐵皮石斛多糖的單糖組成及其含量Table 10 Monosaccharide composition and content of polysaccharides from Dendrobium officinale

2.4 相關性分析

2.4.1 干鐵皮石斛的質構-多糖含量的相關性分析

由表11分析結果可知，鐵皮石斛多糖含量與其硬度呈極顯著正相關，與剪切力呈顯著負相關，與剪切位移呈極顯著負相關。說明干品鐵皮石斛多糖的含量與其質構有關，多糖含量越高，石斛的硬度越大，而剪切力和剪切位移越小。此外，剪切位移與硬度呈顯著的負相關，與剪切力呈顯著的正相關。

表11 石斛多糖含量與質構的相關性分析Table 11 Correlation analysis between Dendrobium polysaccharide content and texture

注：相關系數臨界值，當α=0.01時，r(15)=0.606；α=0.05時，r(15)=0.482(下同)

為了建立干品石斛的質構與其多糖含量的相關性，對硬度、剪切力、剪切位移等質構指標與多糖含量進行逐步回歸分析，得最優(yōu)回歸方程為:

Y=11.038+0.105X1-0.056X2

式中：X1為石斛的硬度，X2為石斛的剪切力。它們與多糖含量的多元相關在α =0.05水平顯著(P<0.05)。由偏回歸系數分析可知，對石斛多糖含量影響最大的因素是硬度，剪切力次之。

2.4.2 干鐵皮石斛的多糖-其他活性物質的相關性分析

對石斛漿的質構、感官評分與其多糖含量做相關性分析，結果如表12所示。

表12 石斛多糖含量與其他活性成分的相關性分析Table 12 Correlation analysis between Dendrobium polysaccharide content and other active ingredients

由表12的相關性表明，除了多糖含量與醇溶性浸出物相關性顯著外，石斛的多糖含量與黃酮含量、可溶性物質含量、生物堿以及水溶性浸出物沒有明顯的相關性。以多糖為Y值，黃酮、可溶性物質、生物堿以及水醇溶性浸出物為自變量，對其做多元回歸方程發(fā)現，黃酮、可溶性固形物、生物堿以及水醇溶性浸出物這5個自變量對鐵皮石斛多糖含量的影響都不顯著(P>0.05)，而且以此建立的多元回歸方程擬合程度不高，模型不顯著(P>0.05)。

3 結論與討論

上述結果表明，產地對鐵皮石斛硬度、剪切力和剪切位移等物性和鐵皮石斛多糖、生物堿、黃酮等活性成分以及浸出物及其可溶性固形物含量有極顯著影響。其中，湖南龍石山鐵皮石斛的硬度、剪切力、黏度以及多糖含量最大；廣東高要鐵皮石斛的可溶性固形物和黃酮的含量最高；浙江臺州黃巖區(qū)鐵皮石斛的醇溶性浸出物含量最高，其香氣和滋味最好；云南保山龍陵縣鐵皮石斛的水溶性浸出物和生物堿的含量最高；云南玉溪鐵皮石斛的黏稠度最大但多糖含量最低且不含生物堿。目前判斷鐵皮石斛質量好壞的方法主要是通過多糖含量來判斷。所以本文也通過分析鐵皮石斛的多糖含量與質構以及其他活性成分之間的相關性來判斷7個地區(qū)的品質差異。發(fā)現鐵皮石斛多糖含量與其硬度呈極顯著正相關，而與其他活性成分沒有明顯的相關性。從硬度與多糖含量之間的關系可得出湖南龍石山鐵皮石斛的質量最好。其原因可能與湖南低緯度的地理位置和中亞熱帶季風濕潤氣候有關。而且在秋冬季的時候，湖南的晝夜溫差比較大，能更好地通過調節(jié)棚內的濕度以及溫度來保證鐵皮石斛的生長。此外，一定的低溫可促進多糖的積累。所以湖南龍石山的鐵皮石斛的多糖和硬度最大。其他地區(qū)的多糖含量未達到藥典的規(guī)定值，主要原因是該鐵皮石斛的生長年限較短。有研究[35]發(fā)現5年生的鐵皮石斛的多糖含量最高，而一年生的多糖含量最低。胡培等[36]也發(fā)現武當山地區(qū)不同生長年限的鐵皮石斛中只有兩年生的莖中多糖和甘露糖的含量達到了藥典標準。另外，種植方式也會影響鐵皮石斛的多糖和甘露糖含量[37]，仿野生種植方式多糖含量最高，而大棚種植方式的多糖含量較低，難以達到藥典標準值。不同光照條件也會影響鐵皮石斛多糖含量，邵蔚等[38]證實采用不遮光和雙層遮陰網的光照條件，鐵皮石斛的多糖含量均未達到藥典標準。

醇溶性浸出物的變化一般跟新芽萌發(fā)、生長期和季節(jié)有關。在夏季時，植株的各種生理活動活躍，生長旺盛，其醇溶性浸出物含量的增加速率和增加量比秋冬的快[39]。所以即使在同一時間采集，也會因各地區(qū)氣候的差異而導致醇溶性浸出物的含量不同。有研究證明[40]，在排除水分含量的影響下，可溶性糖含量與光照強度增加呈正相關關系，在360 μmol/(m2·s)的光照強度和 40%水分含量下，可溶性糖含量達到最大值。即濕熱的廣東地區(qū)比較適合鐵皮石斛可溶性固形物的積累。徐步青等[41]研究了不同光照強度對鐵皮石斛的影響，發(fā)現鐵皮石斛在500 lx的光照強度下生長30 d，生物堿含量可以高達 0.028%。而云南的全年的光照強度沒有其他地區(qū)那么高，很適合鐵皮石斛的可溶性固形物和生物堿的積累。此外，7種鐵皮石斛的甘露糖與葡萄糖峰面積之比較低，其主要原因是葡萄糖的含量較高，可能因為在栽培期間，7個地區(qū)的鐵皮石斛的開花期受到外界環(huán)境的影響而變短，比如低溫和外源NO。鐵皮石斛開花不僅顯著消耗鐵皮石斛中的多糖，而且還顯著降低多糖中甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖的質量分數，促進木糖和阿拉伯糖的積累[42]。所以在開花期前后采摘，鐵皮石斛的單糖組成含量也有差異。除了地區(qū)的氣候條件對鐵皮石斛的主要成分有所影響，栽培時所控制的環(huán)境條件也會影響鐵皮石斛的生長，比如栽培基質、水肥管理等。因此，往后的研究不僅要深入了解栽培條件與各個地區(qū)氣候的調節(jié)關系，也要建立一種快速簡便地篩選符合要求的鐵皮石斛的方法或體制。