伍燕，朱家豪，汪偉，申利群,3*

1(興義民族師范學院，貴州 興義，562400) 2(廣西民族大學 化學化工學院, 廣西 南寧，550006)3(廣西林產化學與工程重點實驗室, 廣西 南寧，550006)

暗褐網柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)俗稱 “黑牛肝菌”，隸屬牛肝菌目(Boletales)小牛肝菌科(Boletinellaceae)脈柄牛肝菌屬(Phlebopus)[1]，在我國主要分布在云南、貴州、四川和西藏等地[2]，暗褐網柄牛肝菌子實體較大，口感脆嫩，味道鮮美，富含多種氨基酸、糖類、脂肪、萜類、甾類和維生素等成分，經常食用可增強機體免疫力、改善機體微循環(huán)[3]。蘭茂(明朝)所著《滇南本草》對牛肝菌的藥用價值也有記載，稱其有“主治清熱解煩，樣血和平”功效[4]，牛肝菌既有很好的食用價值，也有多種藥用功效，經濟價值高。

牛肝菌一般屬外生菌根菌，人工栽培難以獲得，但因暗褐網柄牛肝菌的營養(yǎng)方式兼具腐生和共生特點，已能實現(xiàn)人工栽培。目前國內外對暗褐網柄牛肝菌的報道主要集中在栽培技術及營養(yǎng)成分的研究上，如KUMLA等混合高粱、雨樹鋸末、真菌宿主溶液成功獲得了人工栽培子實體[5]，劉靜等已成功實現(xiàn)了暗褐網柄牛肝菌的人工和半人工栽培，在鳳凰木、咖啡、茶樹和荔枝樹下栽培均獲得了成功，在云南西雙版納已實現(xiàn)了一定規(guī)模的人工種植。暗褐網柄牛肝菌極高的經濟價值，促使研究優(yōu)良菌株的篩選、菌株交配系、仿生栽培、菌株發(fā)生地的特點和土壤分析方面的報道較多[6-9]。隨著暗褐網柄牛肝菌人工栽培技術取得的進展，已形成研究牛肝菌的模式種，如曹旸等進行了全基因組測序[10]，并采用簡單重復重復序列(simple sequence repeat，SSR)標記技術對暗褐網柄牛肝菌的5個多肽位點開發(fā)了標記，構建了相應的SSR指紋圖譜[11]。牛肝菌含多種生物活性成分，具有多種生理功能[12]，如趙云霞等研究指出，黑牛肝菌多糖能有效提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低丙二醛含量，對急性酒精損傷小鼠的心臟和脾臟有一定保護作用[13]，真菌多糖是活性的物質基礎，但對于暗褐網柄牛肝菌(黑牛肝)多糖的結構特征研究還未見報道，本研究對暗褐網柄牛肝菌的多糖進行了分離純化和結構表征，為暗褐網柄牛肝菌的多糖活性物質研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

暗褐網柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)新鮮菌體，9月份采集于貴州興義，命名為XY9-2。

DEAE-纖維素52、Sephadex G-100，上海瑞永生物科技公司；717陰離子柱、Dextran、葡萄糖、鼠李糖、巖藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖(均為分析純)，索萊寶試劑公司；三氟乙酸、H2SO4、氯仿、正丁醇、無水乙醇等其他試劑(均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

旋轉蒸發(fā)儀RE52-2型，上海亞榮生化儀器公司；Bio-Rad PCR擴增儀、凝膠成像儀，美國伯樂公司；安捷倫1200高效液相色譜儀、自動進樣器、G1352A RID檢測器、7890A-5975C 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、DB-5色譜柱和質譜檢測器，安捷倫科技有限公司；真空冷凍干燥機LGJ-10，北京松源華興科技有限公司；VERTEX 70傅里葉變換顯微紅外/拉曼光譜儀，德國Bruker公司；ThermoScientific Multiskan FC酶標儀，美國賽默飛公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取和ITS鑒定

采集的牛肝菌取菌蓋和菌柄無菌連接處，液氮研磨，提取總DNA[14]，真菌ITS1和ITS4通用引物擴增ITS序列，電泳檢測后送上海生工測序。

1.3.2 粗多糖的提取和純化

新鮮子實體250 g按1∶1質量比加ddH2O勻漿，沸水煮60 min，過濾后重復1次，合并2次濾液[15]。經熱水浸提后的濾液按體積比4∶1加入氯化717陰離子柱，50 ℃、180 r/min振蕩，保持4 h脫色，脫色后按Sevag法脫蛋白；將脫色、脫蛋白后的粗糖提取液100 mL過DEAE-52纖維柱，分別用ddH2O和不同濃度NaCl(0.05、0.1、0.2和0.3 mol/L)洗脫柱子(流速2 mL/min)，用蒽酮-硫酸法檢測多糖濃度并收集管中多糖溶液，在紫外620 nm處檢測并繪制洗脫曲線；收集主要洗脫峰裝入3 500 MW透析袋，用ddH2O脫鹽(4 ℃透析48 h)；透析后用Sephadex G-100柱子進一步純化(ddH2O洗脫)，多糖溶液經低溫冷凍干燥得到精制多糖。

1.3.3 暗褐網柄牛肝菌多糖紅外光譜

取1 mg暗褐網柄牛肝菌精制多糖，常規(guī)壓片后進行紅外掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.4 暗褐網柄牛肝菌多糖分子質量

1.3.4.1 標準曲線的繪制

分別稱取適量的Dextran標準品，將其配制成質量濃度3 g/L的對照品溶液，逐一進行HPLC檢測，根據標準糖分子質量的保留時間(retention time，RT)繪制標準曲線，得出回歸方程。

1.3.4.2 樣品色譜條件

準確稱取一定量的樣品，用ddH2O配制成1 g/L 的溶液，Millipore 0.45 μm水系濾膜過濾，進樣檢測。TSKgel@G5000PWXL凝膠色譜柱，柱溫20 ℃，0.002 mol/L NaH2PO4為流動相，流速0.6 mL/min。

1.3.5 暗褐網柄牛肝菌多糖單糖成分及摩爾比

1.3.5.1 多糖水解及柱前衍化

取10 mg多糖樣品于梨形瓶中，加入2 mL 2 mol/L H2SO4，充入N2并在油浴鍋里100 ℃水解8 h，水解結束后用0.3 mol/L NaOH中和至中性，離心取上清液200 μL，依次加入100 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液和100 μL 0.3 mol/L NaOH，70 ℃水浴60 min，冷卻后加入100 μL 0.3 mol/L 的HCl，混勻后加入1 mL CCl3萃取，離心取上清。重復3次，過0.22 μm水相濾膜備用。標準品同法處理。

1.3.5.2 色譜條件

流動相為0.05 mol/LV(磷酸鹽)∶V(乙腈)=82 ∶12)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為250 nm，柱溫為30 ℃。

1.3.6 暗褐網柄牛肝菌多糖甲基化

1.3.6.1 甲基化及解聚

取2 mg多糖樣品置于梨型瓶中，加入1 mL DMSO，溶解后加入0.6 mL 0.375 mol/L的NaOH-DMSO懸液，冰浴、緩慢滴加碘甲烷1 mL，混勻后加入3 mL水振蕩終止反應。加入3 mL氯仿萃取，離心取下層有機相，向氯仿相加入少量無水Na2SO4，充分混合以除去殘留的水分，過0.45 μm有機濾膜，收集濾液后用N2吹干。將已完全甲基化的樣品溶于3 mL 90%的甲酸溶液中，密塞，100 ℃解聚3 h，向反應瓶中加入3 mL甲醇，40 ℃下減壓濃縮蒸干，解聚完成。

1.3.6.2 水解及乙酰化

加入3 mL 2 mol/L三氟乙酸，120 ℃下水解4 h，冷卻至室溫，加入0.5 mL甲醇于40 ℃下減壓旋干，徹底去除三氟乙酸。干燥后的樣品加入1 mL濃度為1.6 mol/L鹽酸羥胺溶液(鹽酸羥胺溶于吡啶中)，密閉且充分振蕩，置于90 ℃真空干燥箱中氧化30 min。冷卻至室溫，加入0.2 mL 1-甲基咪唑和1 mL乙酸酐充分振蕩混合均勻。密閉，置于90 ℃真空干燥箱中反應30 min，冷卻至室溫形成乙?；难苌铩＜尤? mL的三氯甲烷和1 mL的水，混勻后靜置數分鐘待分層，去除上層水相，得到的氯仿層加入適量無水Na2SO4去除水分，過0.45 μm的有機系濾膜，置于進樣瓶中進行氣相色譜分析。

1.3.7 暗褐網柄牛肝菌多糖核磁共振

稱取5 mg多糖樣品溶于0.8 mL D2O中，并測定氫譜。

1.3.8 暗褐網柄牛肝菌多糖掃描電鏡鏡像

取少量真空干燥的暗褐網柄牛肝菌多糖樣品固定在樣品架上，真空鍍金，使樣品處于導電狀態(tài)，10 kV電壓下進行電鏡掃描。

2 結果與分析

2.1 子實體鑒定

新鮮子實體菌蓋肥厚，直徑可達4.5～26.0 cm；菌柄粗壯，基部膨大(4.2～9.1)cm×(3.3～6.0)cm，參照《中國真菌志》第22卷《牛肝菌科I》進行形態(tài)學鑒定[16]；圖1為基于ITS序列比對結果，在NCBI上Blast N顯示XY9-2與暗褐網柄牛肝菌HQ687223有100%同源性，經過形態(tài)學和分子生物學鑒定，該野生子實體為暗褐網柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)。

圖1 基于ITS序列構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 NJ Phylogenetic tree based on ITS sequence

2.2 暗褐網柄牛肝菌多糖的分離純化

如圖2所示，粗多糖過DEAE-纖維素柱，不同濃度NaCl洗脫后得到3個組分，收集較多的組分I經透析袋(3 500 Mw)透析后凍干，用ddH2O復溶后過葡聚糖G-100凝膠柱純化，ddH2O洗脫后根據洗脫曲線收集均一組分凍干，得到精制多糖AHP，如圖3所示。

圖2 AHP的DEAE-纖維素離子交換柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of AHP with DEAE-cellulose ion exchange column chromatography

圖3 AHP過凝膠柱G-100Fig.3 Elution curve of AHP with G-100 exchange column chromatography

2.3 紅外光譜分析

如圖4所示，暗褐網柄牛肝菌多糖具有明顯的多糖特征吸收峰，3 409.58 cm-1處較寬的峰是—OH伸縮振動峰，2 923.60 cm-1是糖C—H伸縮振動峰，1 650.79 cm-1是酰胺羰基鍵，1 461.64 cm-1是C—H變角振動峰，1 246.52 cm-1為非對稱的硫酸酯(S=O)伸縮振動特征峰，在1 138.66、1 064.76和1 038.07 cm-13處吸收峰是糖環(huán)上的C—O—C和C—O—H伸縮振動峰，表明存在D-吡喃環(huán)，964.15 cm-1是D-吡喃環(huán)非對稱環(huán)伸縮振動峰，816.30 cm-1是甘露糖吸收峰，762.36 cm-1是D-吡喃環(huán)對稱環(huán)伸縮振動峰[17-19]。紅外分析暗褐網柄牛肝菌多糖AHP為吡喃糖，糖苷鍵類型為α構型。

圖4 AHP紅外圖譜Fig.4 Infrared spectroscopy of AHP

2.4 核磁光譜氫譜

核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance spectra，1H-NMR)主要用于表征糖苷鍵的構型[20]，如圖5所示，C1質子化學位移位于δ 4.8～5.2 ppm，說明暗褐網柄牛肝菌含α型吡喃己糖，與紅外結果相符。在δ 1.25 ppm處為C—6位脫氧糖的甲基質子信號峰。δ 3.5～4.25 ppm多個密集信號峰為不同糖殘基非異頭質子的亞甲基和次甲基上的質子共振峰交互重疊產生，表明暗褐網柄牛肝菌多糖結構復雜。

圖5 AHP的1H-NMR圖譜Fig.5 1H-NMR spectroscopy of AHP

2.5 單糖組成

將多糖酸水解并衍生化后，在相同的高效液相色譜條件下進行單糖與混合單糖標準品比較，結果如圖6所示，暗褐網柄牛肝菌多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖組成，單糖摩爾比為1.54∶0.07∶0.25∶1.72∶0.96，甘露糖和半乳糖含量較多，與前面紅外分析一致。

圖6 AHP的高效液相水解色譜圖Fig.6 HPLC analysis of AHP polysaccharide hydrolysate

2.6 多糖純度及分子質量測定

如圖7所示，高效凝膠滲透色譜(high performance gel-permeationchromatography,HPGPC)檢測暗褐網柄牛肝菌多糖呈單一狹窄對稱峰，表明多糖AHP為均一組分，依據標準曲線得到回歸方程：lgMw=-0.411x+10.414，R2=0.997 5，在保留時間為14.86 min時，分子質量為2.03×104Da。

圖7 AHP純度及HPGPC圖Fig.7 Distribution of purity and HPGPC of AHP

2.7 多糖甲基化分析

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(gas chrmatography mass spectrometry，GC-MS)對甲基化的AHP糖苷鍵進行分析，結果如表1所示，AHP是雜多糖，存在9種連接方式：葡萄糖是→1,3)- Glcp連接，含量占20.56%；半乳糖主要是→1,6)- Galp，含量占32.71%；半乳糖還存在→1)- Galp，→1,3)- Galp殘基，占所有殘基的14.01%，其中→1)- Galp為非還原性末端基；其他巖藻糖和鼠李糖含量低，主要是→1,6)-Fucp和→1,3)- Rhap；甘露糖存在→1,2)- Manp，→1,6)- Manp和→2,4)- Manp 3種殘基，占所有殘基的27.68%；以上結果表明主鏈鍵型是1,3-或1,6-連接的多糖，單糖組成與前面HPGPC單糖組成分析一致。

表1 暗褐網柄牛肝菌多糖甲基化實驗結果Table 1 Methylation analysis data of P. portentosus polysaccharide

2.8 掃描電鏡分析

如圖8所示，掃描電鏡下觀察到暗褐網柄牛肝菌多糖AHP以疏松多孔的網格狀為主，間隙分布有球狀和少量絲狀結構，在500倍電鏡下，可見大面積具長鏈的多分枝結構，分子間交叉相連，說明暗褐網柄牛肝菌多糖的分子質量較大；在2 000倍電鏡下可見網狀結構邊緣是光滑、平整的，說明分子間有相互作用力，能形成緊密而穩(wěn)定的結構。

a-500放大倍率；b-1 000放大倍率;c-2 000放大倍率圖8 暗褐網柄牛肝菌多糖AHP的SEM圖像Fig.8 SEM images of AHP polysaccharide

3 結論

從暗褐網柄牛肝菌中分離到的多糖AHP，色澤乳白，質地較輕、能溶于水。精制多糖AHP的分子質量為2.03×104Da，分子質量較大對保證多糖的生理活性具有重要作用，水解后單糖組成為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖，單糖摩爾比為1.54∶0.07∶0.25∶1.72∶0.96，真菌提取的多糖甘露糖含量相對較多，說明甘露糖對維持真菌多糖大分子結構有重要作用[21-33]。甲基化表明AHP主鏈結構復雜，鍵型有→1,6)- Galp半乳聚糖，占32.71%；→1,3)- Glcp葡聚糖占20.56%，→2,4)- Manp甘露聚糖占19.62%，此外還有→1,3)鼠李糖，→1,6)-巖藻糖和部分→1)、→1,3)半乳糖和少量→1,2)、→2,4)甘露糖形成的糖苷鍵，多糖中多位點連接在掃描電鏡下顯示出交錯而又致密的結構。本研究對暗褐網柄牛肝菌多糖進行了分離純化和結構表征，為進一步研究暗褐網柄牛肝菌多糖的活性奠定了理論基礎，也可為真菌多糖的衍生化研究提供依據。