黃昕畑， 張白曦， 陳海琴， 張 灝， 陳 衛(wèi)

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

反10，順12-共軛亞油酸（t10，c12-CLA）是一種具有兩個(gè)共軛雙鍵的十八碳二烯酸，是共軛亞油酸最重要的活性單體之一[1]。t10，c12-CLA 具有多種生理功能，如減少機(jī)體脂肪積累、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等[2]。 該脂肪酸也因此成為目前研究的熱點(diǎn)，在食品工業(yè)和藥品、保健品行業(yè)擁有巨大的發(fā)展前景。

來源于痤瘡丙酸桿菌的亞油酸異構(gòu)酶（PAI）是惟一一種晶體結(jié)構(gòu)已知的亞油酸異構(gòu)酶[3]。 由于痤瘡丙酸桿菌是一種致病菌，因此將PAI 在其他宿主微生物中表達(dá)迫在眉睫，在這之中研究最多的就是PAI 在大腸桿菌的表達(dá)。 研究表明， 在大腸桿菌中PAI 多以不可溶的包涵體形式存在[4-5]；將PAI 與組氨 酸 標(biāo) 簽 （His-tag）、 谷 胱 甘 肽 巰 基 轉(zhuǎn) 移 酶（Glutathione S-transferase，GST）和小分子泛素樣修飾蛋白（Small ubiquitin-likemodifier，SUMO）融合表達(dá)也不能有效減少其包涵體的形成，PAI 活性蛋白的表達(dá)量依然很低[6-8]，這給PAI 未來的應(yīng)用造成了困難。 因此，作者通過基因工程手段，將能夠提高蛋白質(zhì)可溶性的標(biāo)簽——麥芽糖結(jié)合蛋白 （Maltosebinding protein， MBP）與PAI 在低溫誘導(dǎo)表達(dá)載體pColdV 中融合表達(dá)，通過優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，提高了PAI 在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)水平，并將重組融合蛋白純化得到了具有活性的可溶性蛋白質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株E.coliBL21、E.coliBL21 （DE3）（pET24apai）：均保藏于江南大學(xué)生物技術(shù)中心；質(zhì)粒pColdV：購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶： 購自New England Biolabs （北京）有限公司；氨芐青霉素（Amp）、溶菌酶（lysozyme）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）：購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；MBP 親和層析柱MBPTrap HP：由GE Healthcare 提供；質(zhì)粒小提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒：均購自天根生化科技（北京）有限公司；其余試劑：為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。 全基因合成由金斯瑞生物科技有限公司（南京）提供，本實(shí)驗(yàn)所需的引物合成及測序工作均由華大基因完成。

蛋白質(zhì)純化所需緩沖液配方如下： 結(jié)合緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.4），洗脫緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L 麥芽糖，pH 7.4）。

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨體積分?jǐn)?shù)1%，酵母浸出粉體積分?jǐn)?shù)0.5%， 氯化鈉體積分?jǐn)?shù)1%，pH 7.0，高壓滅菌20 min。 所需抗生素為100 μg/mL 氨芐青霉素。 固體培養(yǎng)基是在上述培養(yǎng)基中加入2 g/L 的瓊脂。

1.4 重組融合蛋白質(zhì)表達(dá)載體的構(gòu)建

以來源于E.coli編碼MBP 的基因malE(Genbank：AHM36606.1)為模板，將malE基因合成并連接至質(zhì)粒pUC57 上，全基因合成由南京金斯瑞公司完成。 分別用KpnI/HindIII限制性內(nèi)切酶雙酶切pUC57-MBP，切下malE基因并切膠回收，與同樣酶切的載體pColdV 在16 ℃連接反應(yīng)過夜，構(gòu)建pCold-MBP 重組質(zhì)粒。

以PAI 的基因pai(Genbank：AX062088)為模板，設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物。 上游引物P1：5’-CCCAAGCTT ATGTCCATCTCGAAGGATTCACG-3’，下游引物P2：5’-GCTCTAGATTACACGAAG AACCGCGTCAC-3’，其中劃線部分分別為限制性酶切酶識(shí)別位點(diǎn)HindIII、XbaI。引物均由華大基因合成。以作者所在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的含有pai基因的質(zhì)粒pET24a-pai為模板，PCR 擴(kuò)增基因pai，PCR 程序?yàn)椋?5 ℃2 min，95 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃24 s， 72 ℃5 min， 30個(gè)循環(huán)。HindIII/XbaI雙酶切純化回收后的PCR 產(chǎn)物， 用并與同樣酶切的pColdV-MBP 載體在16 ℃連接反應(yīng)過夜，轉(zhuǎn)化E.coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 平板上， 挑選菌落，質(zhì)粒抽提并經(jīng)酶切鑒定篩選陽性單克隆并送至華大基因測序，構(gòu)建融合蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒pCold-Mpai。

1.5 重組融合蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

挑取重組菌株單個(gè)菌落， 接種于5 mL 含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜， 再以2%的比例轉(zhuǎn)接于50 mL 含100 μg/mL氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中。

1.5.1 誘導(dǎo)溫度對(duì)MBP-PAI 蛋白表達(dá)的影響 將重組菌株培養(yǎng)3~4 h 至OD600值為0.4~0.5 時(shí)， 取5支試管，每管分裝擴(kuò)大培養(yǎng)液10 mL，分別將試管放在冰水中冷卻培養(yǎng)液到10、15、20、28、37 ℃并放置30 min， 加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L， 分別于10、15、20、28、37 ℃培養(yǎng)24 h。 以4 ℃、10 000 r/min離心收集菌體，并將其重懸于結(jié)合緩沖液中，超聲破碎細(xì)菌并于4 ℃、6 000 r/min 離心10 min， 收集上清液即為全細(xì)胞蛋白質(zhì)，加入適量1×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，吹打混勻后沸水浴10 min，利用SDS-PAGE電泳分析蛋白質(zhì)表達(dá)情況并確定最佳誘導(dǎo)溫度。

1.5.2 誘導(dǎo)劑IPTG 濃度對(duì)MBP-PAI 蛋白表達(dá)的影響 將重組菌株在搖瓶中培養(yǎng)至OD600為0.4~0.5時(shí)，取5 支試管，每管分裝擴(kuò)大培養(yǎng)液10 mL，分別按0.01、0.05、0.1、0.5、1 mmol/L 的終濃度加入誘導(dǎo)劑IPTG，15 ℃下培養(yǎng)24 h，離心、破碎菌體后收集上清液作為全細(xì)胞蛋白質(zhì)， 利用SDS-PAGE 分析、比較蛋白質(zhì)表達(dá)量的多少以確定最佳誘導(dǎo)濃度。

1.5.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)MBP-PAI 蛋白表達(dá)的影響 加入IPTG 至終濃度為0.1 mmol/L， 在15 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)，在培養(yǎng)3、6、12、18、24 h 時(shí)分別取10 mL 菌液，離心收集菌體并超聲破碎，再次離心收集上清液并利用SDS-PAGE 研究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)重組蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。

1.6 最佳誘導(dǎo)條件下MBP-PAI 蛋白的可溶性表達(dá)量比較

將本研究構(gòu)建的重組菌株在上述最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)表達(dá)，取全細(xì)胞蛋白質(zhì)于4 ℃、12 000 r/min再次離心20 min，取上清液即為可溶性蛋白質(zhì)。 將全細(xì)胞蛋白質(zhì)與可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE 分析， 并與本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有pai基因的E.coliBL21（DE3）（pET24a-pai）進(jìn)行可溶性表達(dá)比較，以研究融合標(biāo)簽MBP 對(duì)PAI 可溶性表達(dá)的影響。

1.7 MBP-PAI 重組蛋白的純化

將MBP 親和層析柱用結(jié)合緩沖液預(yù)先平衡，待層析柱完全平衡后， 將MBP-PAI 可溶性蛋白以0.5 mL/min 的速度緩慢上樣至層析柱，靜置0.5 h 使蛋白質(zhì)與柱填料充分結(jié)合； 再用結(jié)合緩沖液以1 mL/min 的速度進(jìn)行洗脫，并同時(shí)用紫外檢測器（280 nm）和記錄儀觀察洗脫情況，待洗脫液中無蛋白質(zhì)后， 換含有10 mmol/L 麥芽糖的洗脫緩沖液洗脫MBP-PAI 融合蛋白，洗脫速度為1 mL/min。 收集各階段樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測。

1.8 酶活測定

酶活測定方法參考宋宇航酶活測定方法[9]。 將底物L(fēng)A 與適量粗酶液或純化后的蛋白質(zhì)反應(yīng)1 h，經(jīng)氯仿-甲醇提脂，并用重氮甲烷甲酯化，進(jìn)行氣相色譜測定。

以LA 轉(zhuǎn)化生成t10，c12 -CLA 的轉(zhuǎn)化率代表PAI 粗酶液的酶活， 轉(zhuǎn)化率%=[CLA]/([LA]+[CLA])×100%。 以氣相色譜結(jié)果計(jì)算純蛋白質(zhì)的比酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合表達(dá)載體pCold-MPAI 的構(gòu)建及鑒定

對(duì)轉(zhuǎn)化后的陽性克隆子進(jìn)行鑒定， 用KpnI/XbaI雙酶切的結(jié)果見圖1。 雙酶切后分別產(chǎn)生大小約為4 398 bp 和2 418 bp 的產(chǎn)物，與預(yù)期相符。 將重組質(zhì)粒送至測序， 序列與Genbank 比對(duì)一致，無移位與突變。

圖1 重組質(zhì)粒pCold-Mpai 的圖譜（a）及雙酶切鑒定電泳圖譜（b）Fig. 1 Map of pCold-Mpai (a) and restriction map of pCold-Mpai(b)

2.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

誘導(dǎo)溫度是重組菌體的生長和蛋白質(zhì)表達(dá)的一種重要影響因素。 為了探究最佳的誘導(dǎo)溫度，將重組蛋白MBP-PAI（90 000）分別在10、15、20、28、37 ℃下進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE 電泳結(jié)果見圖2。在誘導(dǎo)溫度為10、15、20 ℃時(shí)， 灰度掃描分析重組蛋白MBP-PAI 表達(dá)量基本相同，15 ℃表達(dá)量略高于其他兩組；隨著誘導(dǎo)溫度繼續(xù)升高至28 ℃時(shí)，表達(dá)量明顯降低；誘導(dǎo)溫度繼續(xù)升高為37 ℃時(shí)，MBP-PAI表達(dá)情況與空載體對(duì)照相比無差異，灰度掃描分析也證明了MBP-PAI 無表達(dá)。 因此，重組菌株的最佳誘導(dǎo)溫度為15 ℃。pColdV 是一個(gè)冷休克表達(dá)載體，它利用了大腸桿菌的低溫表達(dá)基因cspA作為啟動(dòng)子調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)，因此，較高的溫度不利于該啟動(dòng)子發(fā)揮其作用，這一結(jié)果也與Qing 的研究一致[10]。

圖2 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白MBP-PAI 表達(dá)的影響Fig. 2 Effect of different induction temperature on the expression of MBP-PAI

2.3 誘導(dǎo)劑IPTG 濃度對(duì)MBP-PAI 蛋白表達(dá)的影響

為了探究誘導(dǎo)劑對(duì)于重組蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，設(shè)置了5 個(gè)不同的IPTG 濃度梯度， 分別為0.01、0.05、0.1、0.5、1 mmol/L。 將重組菌株在15 ℃下誘導(dǎo)24 h 后，取胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果見圖3。 與空白對(duì)照相比，在這5 個(gè)不同的IPTG 濃度下重組蛋白質(zhì)均有表達(dá)。 當(dāng)IPTG 濃度由0.01 mmol/L上升至0.1 mmol/L 時(shí)，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量明顯增大，在濃度為0.1 mmol/L 時(shí)，蛋白質(zhì)表達(dá)量達(dá)到最高；但隨著IPTG 濃度繼續(xù)增大，表達(dá)量明顯降低。這證明較高的IPTG 濃度會(huì)影響菌株正常生長，從而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)量。 為了減少IPTG 對(duì)細(xì)菌毒性作用，確定IPTG 最佳濃度為0.1 mmol/L。

2.4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)MBP-PAI 蛋白表達(dá)的影響

為了使重組蛋白質(zhì)最大量表達(dá)，我們在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 進(jìn)一步對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，見圖4。 在3~12 h 范圍內(nèi)， 隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，MBP-PAI 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量逐漸增大； 在12 h之后，目的蛋白質(zhì)表達(dá)量趨于穩(wěn)定。 為了提高效率，確定誘導(dǎo)表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為12 h。

2.5 最佳誘導(dǎo)條件下重組蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)情況

圖3 不同IPTG 濃度對(duì)重組蛋白MBP-PAI 表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of IPTG on the expression of MBP-PAI

圖4 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白MBP-PAI 表達(dá)的影響Fig.4 Effect of induction time on the expression of MBP-PAI

在上述確定的最佳誘導(dǎo)條件（誘導(dǎo)溫度15 ℃、IPTG 添加量0.1 mmol/L 、誘導(dǎo)時(shí)間12 h）下，比較融合蛋白MBP-PAI 與非融合蛋白PAI 的可溶性表達(dá)情況， 以確定融合標(biāo)簽MBP 對(duì)PAI 可溶性表達(dá)的影響。SDS-PAGE 結(jié)果見圖5，泳道1、2 分別為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組菌株的可溶性蛋白質(zhì)和全細(xì)胞蛋白質(zhì)，箭頭所示為融合蛋白MBP-PAI 的條帶；泳道3、4 分別為將pai 基因單獨(dú)表達(dá)的重組菌株E.coliBL21（DE3）（pET24a-pai）的可溶性蛋白質(zhì)和全細(xì)胞蛋白質(zhì)，箭頭所示為PAI 的條帶（50 000）。分析結(jié)果顯示， 融合蛋白MBP-PAI 在該誘導(dǎo)條件下大量表達(dá)，表達(dá)量約是PAI 的12 倍。 同時(shí)，在電泳圖中可以清楚的看到， 重組蛋白MBP-PAI 大部分以可溶蛋白質(zhì)的形式存在， 而未與MBP 融合的PAI 可溶性表達(dá)量非常低，大部分以包涵體形式存在，二者的可溶性蛋白質(zhì)的比例約為18∶1 （MBP-PAI∶PAI）。證明與MBP 融合表達(dá)后， 無論是PAI 的表達(dá)量還是可溶性表達(dá)量都大幅提高。

圖5 最佳誘導(dǎo)條件下重組蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)情況Fig. 5 Soluble expression of recombinant protein underoptimal induction condition

2.6 MBP-PAI 重組蛋白的純化

經(jīng)MBP 標(biāo)簽親和純化后的結(jié)果見圖6。 泳道1為最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件下重組菌株的可溶性蛋白質(zhì)；泳道2 為上樣后的流出液；泳道3 為經(jīng)結(jié)合緩沖液洗脫的雜蛋白質(zhì)， 可見有極少量MBP-PAI 被洗脫下來，但對(duì)后續(xù)的洗脫影響不大；泳道4 為洗脫緩沖液洗脫下的蛋白質(zhì)， 可見MBP-PAI 融合蛋白純度較高。

圖6 重組菌株E.coli BL21(pCold-Mpai)的表達(dá)產(chǎn)物純化及SDS-PAGE 分析Fig.6 Purification and SDS-PAGE analysis of the expression products of recombinant strain E.coli BL21 (pCold-Mpai)

2.7 MBP-PAI 重組蛋白的酶活測定

分別對(duì)重組菌株E.coliBL21(pCold-Mpai)和對(duì)照菌株E.coliBL21（DE3）（pET24a-pai）的粗酶液進(jìn)行酶活測定并計(jì)算其轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖7。重組菌株MBP-PAI 粗酶液轉(zhuǎn)化率為66.1%，約是對(duì)照菌株的1.5 倍。 這證明融合蛋白質(zhì)能夠轉(zhuǎn)化LA 形成t10、c12-CLA，MBP 能夠通過提高PAI 的可溶性而提高酶的活性。 對(duì)純化后的MBP-PAI 蛋白進(jìn)行酶活性測定， 根據(jù)氣相色譜測定結(jié)果計(jì)算得出比酶活為1.58 U/mg。 以上結(jié)果是MBP 融合標(biāo)簽在蛋白質(zhì)表達(dá)中發(fā)揮優(yōu)勢作用的又一例證。

圖7 MBP-PAI 粗酶液與PAI 粗酶液催化LA 生成CLA的轉(zhuǎn)化率Fig.7 Conversion rate of LA to CLA catalyzed by recombinant MBP-PAI and PAI

3 結(jié) 語

目前，大部分重組蛋白質(zhì)使用的表達(dá)載體是大腸桿菌細(xì)胞，這是因?yàn)榇竽c桿菌表達(dá)的外源蛋白質(zhì)量大， 通常達(dá)到細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)總量的5%~20%，甚至達(dá)到50%以上。 但是，由于大腸桿菌細(xì)胞缺少折疊機(jī)制，當(dāng)外源蛋白質(zhì)大量表達(dá)時(shí)，這些蛋白質(zhì)通常以包涵體形式存在，這些不可溶的蛋白質(zhì)甚至可以占到胞內(nèi)蛋白質(zhì)的50%以上，這大大影響了蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)和應(yīng)用。 PAI 酶在大腸桿菌中的表達(dá)就出現(xiàn)上述情況[3-6，8]。

為了解決這一問題， 作者利用MBP 與PAI 融合表達(dá)，并結(jié)合低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子cspA 的特性，將PAI 在大腸桿菌中融合表達(dá)。 MBP 是一種來自大腸桿菌周質(zhì)的高可溶性蛋白質(zhì)，常被當(dāng)作促溶標(biāo)簽與目的蛋白質(zhì)融合表達(dá)以提高可溶性。 研究表明，當(dāng)麥芽糖結(jié)合在融合環(huán)境中使用時(shí)，MBP 通過顯示分子伴侶的內(nèi)在性質(zhì)來促進(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解，同時(shí)，MBP 還能夠促進(jìn)靶蛋白的適當(dāng)折疊， 有利于靶蛋白的構(gòu)象和活性中心的恢復(fù)[11]。 cspA 是一種低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，啟動(dòng)強(qiáng)度較弱，在較低的溫度下可以使目的蛋白質(zhì)的表達(dá)較為緩慢，有利于蛋白質(zhì)的折疊及細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而形成更多具有活性的可溶性蛋白質(zhì)[12]。 本研究構(gòu)建的重組菌株E.coliBL21 (pCold-Mpai) 結(jié)合了上述兩者的優(yōu)勢，將PAI 在大腸桿菌中高效可溶性表達(dá)，其最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為誘導(dǎo)溫度15 ℃、IPTG 添加量0.1 mmol/L 、誘導(dǎo)時(shí)間12 h。在該誘導(dǎo)條件下，與未融合MBP 的PAI 相比，MBP-PAI 的表達(dá)量是后者的12倍，可溶性表達(dá)量是后者的18 倍。 同時(shí)，與未融合的PAI 相比， 重組蛋白MBP-PAI 的粗酶液酶活是前者的1.5 倍，純化后的融合蛋白MBP-PAI 比酶活為1.58 U/mg，是目前報(bào)道的較高水平。 本研究結(jié)果不僅提供了減少PAI 包涵體的解決方法， 還為PAI在工業(yè)中生產(chǎn)t10，c12-CLA 奠定了基礎(chǔ)。