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咖啡果酒發(fā)酵菌種篩選及香氣成分分析

2020-05-11 11:50梁建平廖留萍李慶聰張洪波
熱帶農(nóng)業(yè)科技 2020年2期
關(guān)鍵詞:總酸糖度果酒

匡 鈺,梁建平,廖留萍,羅 琴,李慶聰,張洪波

(1.云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,云南瑞麗678600;2.德宏州科技情報(bào)研究所,云南芒市678400)

據(jù)農(nóng)業(yè)部發(fā)展南亞熱帶作物辦公室統(tǒng)計(jì),2017 年云南咖啡種植面積11.8 萬(wàn)hm2,占全國(guó)咖啡種植面積的98.43%;咖啡產(chǎn)量14.50 萬(wàn)t,占全國(guó)咖啡產(chǎn)量的98.51%。一般加工1 t 咖啡鮮果產(chǎn)生0.5 t 皮渣(包括果皮、果肉),云南咖啡產(chǎn)區(qū)每年咖啡鮮果處理產(chǎn)生的皮渣約39.68 萬(wàn)t,產(chǎn)量巨大。咖啡果皮中,糖、蛋白質(zhì)、纖維素為主要成分,同時(shí)還含有多酚類物質(zhì)、生物堿性等多種成分,成分豐富,如何綜合利用加工產(chǎn)生的皮渣提高其附加值受到國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。國(guó)外咖啡果皮的綜合利用研究較多,可將咖啡果皮加工成飼料[1]或青貯飼料[2]飼喂動(dòng)物,利用咖啡果皮發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶[3]、單寧酸酶[4]、乳酸[5]、開發(fā)鼠李飲料[6],及制備生物乙醇[7]、生產(chǎn)沼氣[8]等。國(guó)內(nèi)有利用咖啡果肉制成飼料飼喂牲畜[9],提取咖啡果皮中的膳食纖維[10-11],研究提取咖啡果皮粗提物[12],利用咖啡果皮發(fā)酵制備咖啡果酒[13-17]、咖啡果皮茶[18]。

咖啡果皮中含有蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸等17 種氨基酸以及綠原酸、葫蘆巴堿等功能性成分[19],成分豐富,適宜開發(fā)咖啡果皮茶、果酒等產(chǎn)品。本研究旨在利用咖啡果皮發(fā)酵出風(fēng)味典型的咖啡果酒,開發(fā)出咖啡果酒產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)選用3種酵母菌發(fā)酵咖啡果酒,結(jié)合果酒酒度、總酯含量、總酸、感官等指標(biāo)以篩選出適合咖啡果酒發(fā)酵的菌種,并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化;同時(shí)采用頂空固相微萃?。℉S-SPME)技術(shù)聯(lián)合氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法對(duì)咖啡果酒的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,為咖啡果酒開發(fā)提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

咖啡果皮,取自云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所咖啡加工廠;AS2.399,AS2.346,購(gòu)于中科院微生物研究所菌種保藏中心;安琪果酒酵母,湖北安琪酵母股份有限公司。果膠酶,諾維信(中國(guó))生物制劑有限公司;葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂,購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司;NaOH、無(wú)水乙醇、酚酞,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S 型分析天平,北京奧多利斯天平有限公司;SHZ-B 型水浴恒溫振蕩器,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超凈工作臺(tái),上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SPX-250B 型生化培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;萃取頭(50/30 μm,DVB/CAR/PDMS),美 國(guó)Supelco 公 司;毛 細(xì) 管 柱VF-Wax(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美國(guó)Varian 公司;GCMS-QP2010 Plus 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀,日本島津公司;PAL System 三合一進(jìn)樣器,瑞士CTC 公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

咖啡果皮發(fā)酵液中分別接種AS2.399、AS2.346、安琪果酒酵母,綜合咖啡果酒的理化和感官指標(biāo),篩選出適合咖啡果酒發(fā)酵的酵母菌??疾斐跏继嵌取⒔湍妇臃N量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等單因素條件對(duì)酵母菌發(fā)酵性能的影響,優(yōu)化咖啡果酒的發(fā)酵條件。對(duì)在優(yōu)化條件下發(fā)酵的咖啡果酒進(jìn)行香氣成分分析。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 咖啡果皮發(fā)酵液制備

取1 000 g 咖啡果皮,以1∶3 的比例加水,添加果膠酶在35℃條件下酶解3 h,過(guò)濾,加入白糖對(duì)濾液糖度進(jìn)行調(diào)整。加入亞硫酸鈉對(duì)其滅菌,使咖啡果皮發(fā)酵液的SO2濃度達(dá)到60 mg/L,靜置2 h 后待用。分裝在500 mL 三角瓶中,每瓶裝液量為200 mL。

1.4.2 菌種制備

(1)AS2.399、AS2.346 菌種制備

活化斜面:葡萄糖1%,蛋白胨0.5%,酵母膏0.3%、麥芽汁0.3%,瓊脂2%,115℃滅菌30 min。一級(jí)培養(yǎng)基:糖度為10°Be 咖啡果皮酶解液20 mL,置于50 mL 三角瓶中115℃滅菌30 min。接種2 環(huán)活化菌種搖勻,于28℃110 r/min 條件下培養(yǎng)12~16 h。二級(jí)培養(yǎng)基:糖度為10°Be 咖啡果皮酶解液150 mL,置于500 mL 三角瓶中110℃滅菌30 min。 接種10% 一級(jí)培養(yǎng)液搖勻,28℃110 r/min 條件下培養(yǎng)14~16 h。

(2)安琪酵母菌種活化

將安琪果酒酵母溶解在38~40℃含糖2%的溫水中,充分溶解后于28℃110 r/min 條件下培養(yǎng)30 min。

1.4.3 咖啡果酒發(fā)酵

將活化后的AS2.399、AS2.346、安琪酵母分別接種到初始糖度為25°Be 的發(fā)酵液中,在30℃110 r/min 的條件下發(fā)酵10 d,比較發(fā)酵液的酒精度、總酸、總酯、感官評(píng)定等指標(biāo),篩選出較適合的發(fā)酵菌種。對(duì)篩選出的酵母進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化,考察初始糖度、安琪酵母接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)咖啡果酒的酒度、總酸、總酯含量的影響。

1.4.4 酒精度、糖含量、總酯測(cè)定

酒精度測(cè)定:GB/T10345-2007 蒸餾法,使用酒精計(jì)測(cè)定。采用手持糖量計(jì)測(cè)量咖啡果皮發(fā)酵液和發(fā)酵結(jié)束后的糖含量??傰y(cè)定(以乙酸乙酯計(jì)):GB/T 10345-2007,白酒分析方法。

1.4.5 咖啡果酒揮發(fā)性成分分析

取咖啡果酒5 mL 于15 mL 固相微萃取的樣品瓶中,加蓋密封,60℃下恒溫水浴平衡15 min,把老化好的固相微萃取頭插入頂空瓶中萃取吸附45 min 后,自動(dòng)進(jìn)樣,進(jìn)行GC-MS 分析。進(jìn)樣口溫度250℃,解吸5 min。氣相色譜(GC)條件:毛細(xì)管柱VF-Wax(30 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升溫:初始溫度45℃,保留2 min,以5℃/min 的速率升至180℃,再以20℃/min 的速率升至240℃,保留2 min;進(jìn)樣口溫度250℃;載氣高純度氦氣(He),流速1.08 mL/min;無(wú)分流進(jìn)樣。質(zhì)譜(MS)條件:電子電離(electron ionization,EI)源,電子能力70 eV,離子源溫度230℃,四級(jí)桿溫度150℃,全掃描模式,掃描范圍35~500 m/z,溶劑延遲3.5 min。質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)Wiley.lib 數(shù)據(jù)庫(kù)和美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(national institute of standards and technology,NIST)14.lib 譜庫(kù)檢索,對(duì)于匹配度大于90 的化合物進(jìn)行分析,采用峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。

表1 3種菌種發(fā)酵咖啡果酒的理化指標(biāo)及感官比較

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡果酒發(fā)酵菌種比較

果酒釀造過(guò)程中,酵母菌對(duì)酒的品質(zhì)至關(guān)重要。能進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酒的微生物品種繁多,性能各異。本實(shí)驗(yàn)采用安琪果酒酵母、酵母菌AS2.346以及生香酵母AS2.399 來(lái)發(fā)酵咖啡果酒,對(duì)3 種菌種發(fā)酵過(guò)程中的殘?zhí)亲兓⒕凭茸兓肮评砘笜?biāo)和感官進(jìn)行了比較,結(jié)果見圖1、圖2、表1。可以看出,安琪果酒酵母產(chǎn)酒能力、產(chǎn)酒速率優(yōu)于AS2.346、AS2.399,發(fā)酵10 d,安琪果酒酵母酒 度 達(dá) 到10.8° ,AS2.399 發(fā) 酵 酒 度 為8.1° ,AS2.346 發(fā)酵酒度為9.2°(圖1);安琪果酒酵母起酵快,糖的利用率高于AS2.346、AS2.399,發(fā)酵過(guò)程中的糖度降低速率也較平緩(圖2),有利于發(fā)酵的正常進(jìn)行。3 種菌種發(fā)酵出的咖啡果酒均呈琥珀色,具有咖啡果酒應(yīng)有的色澤。AS2.399 發(fā)酵果酒氣味柔和,酒體滋味平淡;AS2.346 發(fā)酵果酒酒體滋味偏薄,整體協(xié)調(diào)性欠佳;安琪果酒酵母發(fā)酵的咖啡果酒酒體滋味飽滿,酒味濃郁,香味稍薄。綜合比較,選擇安琪果酒酵母作為咖啡果酒發(fā)酵菌種。

2.2 安琪酵母咖啡果酒發(fā)酵單因素影響分析

2.2.1 初始糖度

將咖啡果皮發(fā)酵液的初始糖度分別調(diào)整至15、20、25、30、35°Be,接 種 安 琪 果 酒 酵 母200 mg/L,在28℃條件發(fā)酵7 d,測(cè)發(fā)酵液的總酸、總酯、酒精度,結(jié)果如圖3 所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明,隨著糖度的增加,總酸、總酯、酒精度的含量隨之增加,當(dāng)糖度達(dá)到25°Be 時(shí),總酯含量和酒精度達(dá)到最大。初始糖度越高,酒精度越高。當(dāng)初始糖度為25%時(shí),酒精度達(dá)到最大。隨著糖度增加,發(fā)酵液酒精度下降,總酯含量隨著增加,糖度達(dá)到30°Be 時(shí)最大,之后隨之下降;總酸含量出現(xiàn)波動(dòng)。當(dāng)糖含量過(guò)高時(shí),滲透壓抑制了酵母菌的生長(zhǎng)和繁殖,由糖轉(zhuǎn)變?yōu)榫凭^少,酒度降低。因此,選擇25°Be 為最適發(fā)酵初始糖含量。

2.2.2 發(fā)酵溫度

將咖啡果皮發(fā)酵液的初始糖度調(diào)整至25°Be,接種安琪果酒酵母200 mg/L,在20、24、28、32、36℃條件發(fā)酵7 d,測(cè)發(fā)酵液的總酸、總酯、酒精度,結(jié)果如圖4 所示。

發(fā)酵溫度為28℃時(shí),酒精度達(dá)到最高,溫度再高則酒精度下降。溫度較低(20℃)時(shí),酵母菌細(xì)胞新陳代謝活動(dòng)減弱,繁殖速度較慢,酒精體積分?jǐn)?shù)較低,但是有利于酵母菌產(chǎn)酯,總酯含量最高;而發(fā)酵溫度過(guò)高時(shí),酵母菌快速繁殖,大量消耗發(fā)酵液中糖分,導(dǎo)致用于發(fā)酵產(chǎn)生酒精的底物不足,不利于酒精的產(chǎn)生,也使總酯、總酸含量減少,果酒品質(zhì)下降。因此,確定較佳發(fā)酵溫度為28℃。

2.2.3 酵母菌接種量

將咖啡果皮發(fā)酵液的初始糖度調(diào)整至25°Be,分別接種安琪果酒酵母100、200、300、400、500、600 mg/L,在28℃條件發(fā)酵7 d,測(cè)發(fā)酵液的總酸、總酯、酒精度,結(jié)果如圖5 所示。當(dāng)酵母添加量低于200 mg/L 時(shí),發(fā)酵液酒度隨酵母添加量的增加而增大,總酯、總酸含量也增加,當(dāng)酵母接種量大于300 mg/L 時(shí),酒精度、總酯含量開始下降;當(dāng)接種酵母的量過(guò)大時(shí),短時(shí)間內(nèi)酵母菌快速大量繁殖,導(dǎo)致發(fā)酵液中的糖被消耗掉,轉(zhuǎn)化為酒精的少,酒精度降低,同時(shí)總酯含量也降低。因此,選擇酵母菌最適添加量為200 mg/L。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間

將咖啡果皮發(fā)酵液的初始糖度調(diào)整至25°Be,接種安琪果酒酵母200 mg/L,在28℃條件發(fā)酵4、5、6、7、8 d,測(cè)發(fā)酵液的總酸、總酯、酒精度,結(jié)果如圖6 所示。

表2 咖啡果酒揮發(fā)性成分化合物GC-MS分析結(jié)果

由圖6 可以看出,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,發(fā)酵液酒精度、總酸含量、總酯含量增加,發(fā)酵第3~7 d 為主發(fā)酵階段,產(chǎn)酒量快速增加,總酸、總酯大幅增加,7 d 后增加平緩,待發(fā)酵結(jié)束,酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到12.1°。故選擇發(fā)酵時(shí)間為7 d。

綜上,安琪果酒酵母發(fā)酵咖啡果酒的最佳條件為:初始糖度25°Be,發(fā)酵溫度28℃,酵母菌接種量200 mg/L,發(fā)酵時(shí)間7 d。在優(yōu)化條件下進(jìn)行咖啡果酒發(fā)酵試驗(yàn),測(cè)得咖啡果酒酒度為12°,總酸含量1.42 g/L,總酯2.37 g/L。發(fā)酵出的咖啡果酒酒體呈琥珀色,酒味濃郁,香味尚可。

2.3 咖啡果酒揮發(fā)性成分分析

檢測(cè)分析結(jié)果(表2)顯示,咖啡果酒中能檢測(cè)到有保留時(shí)間和峰面積的揮發(fā)性成分100 種,其中SI≥90 的有29 種,占總檢出發(fā)揮性成分的79.53%,主要為醇類、酸類、酯類,以及少量的醛類、烴類和酮類揮發(fā)性成分,其中醇類58.58%、酸類37.23%、酯類3.57%、醛類0.3%、烴類0.23%、酮類0.1%,酯類、醇類揮發(fā)性成分占總揮發(fā)性成分的95.81%。相對(duì)含量較大的成分有10 種,分別為:苯乙醇29.11%、油酸15.05%、異戊醇13.76%、n-棕櫚酸10.39%、亞麻酸8.98%、[R-(R*,R*)]-2,3-丁二醇9.95%、二甲基硅烷二醇4.71%、二十烷酸2.25%、丁二酸二乙酯2.2%、γ-丁內(nèi)酯0.87%。

咖啡果酒揮發(fā)性成分中,醇類所占比例最大。其中,苯乙醇是咖啡果酒中相對(duì)含量最高、主要的揮發(fā)性香味成分,賦予了咖啡果酒淡雅細(xì)膩的玫瑰香味。苯乙醇是一種比較典型的芳香醇[20],閾值為10 mg/L,具有獨(dú)特的丁香、茴香、獨(dú)特的紫羅蘭香以及淡雅細(xì)膩的玫瑰花香,是發(fā)酵酒中主要的醇類物質(zhì)[21]。異戊醇(5.72%)具有蘋果白蘭地香氣,也是發(fā)酵酒普遍存在的醇類物質(zhì)。在白酒中,酸類是形成白酒口味的重要物質(zhì),適量的酸類化合物能夠增強(qiáng)酒的甜味感,消 除酒的苦味[22]??Х裙浦杏退岷孔罡撸?5.05%),其次是n-棕櫚酸、亞麻酸、二十烷酸、辛酸、異戊酸、異丁酸。揮發(fā)性酸類成分中,高級(jí)脂肪酸含量高,辛酸具有草香、果香、花香和酒香。

咖啡果酒揮發(fā)性成分中的酯類相對(duì)含量為3.57%,最多的為丁二酸二乙酯。丁二酸二乙酯有愉快的芳香味、酒味。咖啡果酒揮發(fā)性成分中除了醇類、酸類、酯類,還有少量的醛類、烴類和酮類物質(zhì)。醛類物質(zhì)中壬醛具有油脂氣味和甜橙氣息;癸醛具微甜,有果香以及玫瑰氣味。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比AS2.399、AS2.346、安琪果酒酵母發(fā)酵的咖啡果酒的酒度、總酯含量、總酸、感官等指標(biāo),篩選出安琪酵母作為咖啡果酒發(fā)酵酵母菌,條件優(yōu)化得到其發(fā)酵最佳條件為:初始糖度25° Be,發(fā) 酵 溫 度28℃,酵 母 菌 接 種 量200 mg/L,發(fā)酵時(shí)間7 d,發(fā)酵的咖啡果酒酒度為12°,總酸含量1.42 g/L,總酯2.37 g/L。檢測(cè)分析到咖啡果酒的29 種主要揮發(fā)性成分,主要包括醇類、酸類、酯類,以及少量的醛類、烴類和酮類。與胡榮鎖[16]報(bào)道的單菌發(fā)酵對(duì)咖啡果酒風(fēng)味影響結(jié)果相比較,安琪酵母發(fā)酵的咖啡果酒酒度要高,但是果酒風(fēng)味成分差異較大,風(fēng)味成分中酯類含量高,其次為醇類,還有少量的醛類、酸類和酮類。存在的差異源于所選的酵母不同,代謝產(chǎn)物也不盡相同。

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