徐曉瀅 樊艷 徐楊穎 周建新

[摘要]：本文在高效液相色譜法測定嘔吐毒素（DON）改進(jìn)的基礎(chǔ)上，研究了小麥籽粒中嘔吐毒素分布和臭氧處理對(duì)小麥中嘔吐毒素的降解。結(jié)果表明利用改進(jìn)的高效液相色譜法對(duì)樣品中嘔吐毒素測定，矯正曲線在0～5.0μg/ml，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 8，選擇三個(gè)不同水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率在85.0%～105%。嘔吐毒素主要存在于麩皮中，臭氧處理可以降解40%以上的嘔吐毒素。

[關(guān)鍵詞]小麥;嘔吐毒素;臭氧;高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：TS211 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202002

真菌毒素是由各自所屬的真菌代謝生成的有機(jī)代謝物，廣泛分布在自然界中，對(duì)人類的食物和飼料造成了廣泛的污染，造成數(shù)以千萬計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失。真菌毒素屬于天然化學(xué)污染物，目前，人們可以確定檢測的真菌毒素大概有300種，由350種真菌產(chǎn)生[1]。其中嘔吐毒素（學(xué)名為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，簡稱DON）現(xiàn)在被認(rèn)為是世界上常見的危害物中最危險(xiǎn)的類型之一，在鐮刀菌毒素之中，嘔吐毒素對(duì)谷物造成的污染率和污染水平是最高的[2]。世界上很多國家都通過法規(guī)或者標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格規(guī)定了嘔吐毒素在糧食及其制品中限量。因此，如何去除谷物（特別是小麥和玉米）中的DON毒素，以減少其進(jìn)入面制品甚至食物鏈的研究需求越來越迫切。嘔吐毒素降解的方法主要有物理、生物和化學(xué)方法。由于嘔吐毒素具有耐熱性，導(dǎo)致物理方法的適用性不強(qiáng)，且降解產(chǎn)物難以確定，也難以做出安全性評(píng)判;生物方法降解真菌毒素的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，具有高效性和專一性，但性價(jià)比較低且較難適用于固體?；瘜W(xué)方法主要是通過強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或者強(qiáng)氧化劑對(duì)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，致使毒素被降解[3]。近年來，臭氧被利用于減少糧食和食品中的真菌毒素如赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1的研究比較多，在實(shí)踐中也得到肯定[4-8]，對(duì)于臭氧降低小麥中嘔吐毒素的研究相對(duì)較少。臭氧自身具有很大優(yōu)勢：它可以迅速破壞有機(jī)物中的雙鍵;具有極強(qiáng)的滲透性;可以分解為氧氣，不會(huì)產(chǎn)生有毒殘留，對(duì)環(huán)境無不良影響[9]，所以研究臭氧降解小麥中的DON含量的工藝參數(shù)，對(duì)于確保食品安全，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 樣品

小麥樣品來自江蘇南通，2017年3月9日采樣。其中，樣品A嘔吐毒素污染程度高;樣品B嘔吐毒素污染程度低。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（2707-1525-2998）：美國Waters公司;Bond Elut Mycotoxin多功能凈化柱（12165001B）：美國Agilent公司;臭氧滅菌箱（JR-Y10）：南京金仁環(huán)?？萍加邢薰?旋轉(zhuǎn)式粉碎機(jī)（D-47055）：德國brabender公司;高速離心機(jī)（GL-21M）：上海耐圣卡蘭實(shí)業(yè)有限公司;渦旋振蕩器（QL-862）：Qilinbeier公司;氮吹儀（N- EVAPTM112）：美國Organomation Asso-ciates公司;Clover C18色譜柱（4.6mm×250mm）、填料（粒徑5μm）：美國Waters公司。

1.3 試劑

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司;甲醇、乙腈（色譜純）：德國LiChrosolv公司。

1.4 嘔吐毒素的檢測方法研究

1.4.1 色譜條件

檢測波長：218nm;流動(dòng)相：甲醇∶水（20∶80）;柱溫：35℃;流速：0.8mL/min;進(jìn)樣量：50μL;根據(jù)樣品的峰保留時(shí)間對(duì)樣品進(jìn)行定性，根據(jù)峰面積外標(biāo)法對(duì)樣品進(jìn)行定量。

1.4.2 樣品制備

參照《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》（GB 5009.111-2016）[10]中的免疫親和層析凈化高效液相色譜法，并對(duì)試樣提取、凈化和洗脫等步驟進(jìn)行了改進(jìn)：稱取25g磨碎的小麥樣品于離心杯中，加入乙腈∶水=84∶16（V∶V）溶液100mL，手持離心杯在渦旋振蕩器上振蕩3min，經(jīng)高速離心機(jī)（10 000r/min）離心20min，準(zhǔn)確吸取上清液4mL，注入玻璃注射器中，連接空氣壓力泵，設(shè)置通過時(shí)間為5min，在壓力作用下使溶液快速通過多功能凈化柱，收集濾液。氮吹濾液至溶劑全部被吹干，然后使用乙腈∶水=20∶80（V∶V）溶液1mL復(fù)溶。將復(fù)溶溶液過0.22μm微孔濾膜，溶液收集于2mL樣品瓶中待高效液相色譜儀分析。

1.4.3 回收率測定

取陰性樣品的小麥磨碎，稱取25g至于離心杯中，共5份，分別向其中添加濃度為0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg的DON標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行處理與檢測，處理步驟同樣品制備。

1.4.4 預(yù)處理平行試驗(yàn)

取小麥樣品中DON超標(biāo)的小麥芯粉樣品6份，進(jìn)行處理與檢測，處理步驟同樣品制備。

1.5 嘔吐毒素含量在小麥籽粒中的分布

小麥碾磨工藝按照我國農(nóng)業(yè)部頒布的《小麥實(shí)驗(yàn)制粉 第1部分：設(shè)備、樣品制備和潤麥》（NY/T 1094.1-2006）[11]執(zhí)行。打開粉碎機(jī)，使其正反空轉(zhuǎn)各5min，直至到收集倉中不再出現(xiàn)粉末。打開轉(zhuǎn)向旋鈕，從入口處緩慢投入過篩后的小麥樣品100g，碾磨結(jié)束后，兩個(gè)收集倉分別有麩皮和芯粉，將其分開取出存放。之后采取上述除盡粉末殘留的方法反復(fù)收集，使樣品充分碾磨。

1.6 臭氧處理對(duì)小麥中嘔吐毒素含量的影響

1.6.1 臭氧處理時(shí)間對(duì)小麥中嘔吐毒素含量的影響

小麥樣品A 5份，將臭氧處理時(shí)間分別設(shè)置為30min、60min、90min、120min、150min，處理濃度10g/h取出，按2.4方法測定嘔吐毒素含量。

1.6.2 臭氧處理濃度對(duì)小麥中嘔吐毒素含量的影響

小麥樣品A 4份，將臭氧濃度分別設(shè)置為2.5g/h、5g/h、7.5g/h和10g/h，處理時(shí)間90min后取出，按2.4方法測定嘔吐毒素含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜法測定小麥中嘔吐毒素的方法2.1.1 校正曲線及回歸方程

將嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL，有低到高濃度依次進(jìn)樣檢測，得到如圖1所示的嘔吐毒素校正曲線，相關(guān)系數(shù)0.999 871，回歸方程為Y=7.579 58×104-3.094 061 ×103。嘔吐毒素的標(biāo)準(zhǔn)圖譜如圖2所示。

2.1.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

分別做500μg/kg、1 000μg/kg、2 000μg/kg三個(gè)添加水平的回收試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

2.1.3 預(yù)處理平行實(shí)驗(yàn)

樣品A的芯粉樣品，進(jìn)行從預(yù)處理開始的5次重復(fù)試驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)如表2所示。

2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)于同一個(gè)經(jīng)過預(yù)處理的小麥樣品，在高效液相色譜中重復(fù)進(jìn)樣6次，可得到含量數(shù)據(jù)如表3所示。

由上述實(shí)驗(yàn)可知，在0～5.0μg/ml時(shí)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999，不同水平的回收率在85.0%～105%，預(yù)處理平行實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為12.37%，多次進(jìn)樣精密度實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%。該方法準(zhǔn)確可靠，簡便易行。

2.2 小麥籽粒中嘔吐毒素的分布情況

碾磨100g小麥，稱量得到的麩皮和芯粉的重量。其中麩皮約25g，占比25%;芯粉約70g，占比70%，其余為損耗。測定結(jié)果如表4所示。對(duì)于DON污染程度高的樣品A，全麥粉中嘔吐毒素含量為4 590μg/kg，是國家標(biāo)準(zhǔn)限量4.5倍（限量1 000μg/kg），麩皮中的嘔吐毒素含量是芯粉中的2倍。對(duì)于DON污染程度低的樣品B，所有的DON都集中分布于麩皮中，芯粉中不含有DON。

2.3 臭氧處理對(duì)小麥中嘔吐毒素含量的影響

2.3.1 臭氧處理時(shí)間對(duì)小麥中嘔吐毒素的影響

將樣品A分別在相同臭氧濃度（10g/h）處理不同時(shí)間后取出，碾磨，對(duì)DON含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如表5所示。由表5可知，小麥籽粒中的DON都因?yàn)槌粞跆幚矶档?，且降解率與處理時(shí)間呈正相關(guān)。

2.3.2 臭氧處理濃度對(duì)小麥中嘔吐毒素的影響

將小麥樣品分別置于5個(gè)濃度梯度的臭氧環(huán)境中90min，然后測得其中的DON含量如表6所示。由DON的變化趨勢圖可以看出，相同處理時(shí)間內(nèi)，當(dāng)改變臭氧濃度對(duì)小麥進(jìn)行講解處理。在濃度小于7.5g/h時(shí)，小麥全麥粉中中DON的含量也會(huì)逐漸下降，且降低速率逐漸減小，濃度為7.5g/h時(shí)，降解率為41.18%，繼續(xù)提高臭氧濃度，DON的降解率的變化則在3%左右，下降效果不明顯。麩皮與芯粉的變化趨勢與小麥粉相同。所以，當(dāng)臭氧處理小麥的時(shí)間為90min的時(shí)候，臭氧降解DON的濃度可選擇7.5g/h。

3 結(jié) 論

本方法與《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》（GB 5009.111-2016）相比，在試驗(yàn)提取、凈化和洗脫方面，本實(shí)驗(yàn)采用均質(zhì)并離心后提取上清液的方式，對(duì)嘔吐毒素進(jìn)行溶解，利用多功能凈化柱對(duì)其進(jìn)行凈化。由精密度檢測結(jié)果可知平行實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為12.37%，儀器精密度測試相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%，方法具有可行性。

DON在麩皮中的含量都要高于在芯粉中的含量，主要分布在麩皮中，通過去皮，可去除部分嘔吐毒素。

隨著臭氧處理濃度的提高和時(shí)間的延長，小麥籽粒中DON降解率逐漸提高，臭氧處理濃度7.5g/h和時(shí)間為90min時(shí)，降解率可達(dá)到45%。

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收稿日期：2019-12-23

基金項(xiàng)目：江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）;江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目（TAPP）。

作者簡介：徐曉瀅，女，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。

通信作者：周建新，男，碩士，研究方向?yàn)榧Z油儲(chǔ)藏。