石亞星，周 珈，王小瑩，錢忠義，申麗娟，章宗籍

（昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，云南昆明 650500）

肝臟疾病在我國各類疾病中占有較大比例，尤其乙型肝炎（簡稱乙肝），是最常見的肝臟疾病類型。除乙肝外，自身免疫性肝病，如原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC），現(xiàn)稱原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）、原發(fā)性膽汁性膽管炎合并自身免疫性肝炎（primary biliary cholangitis combined with autoimmune hepatitis，PBC-AIH）等肝臟疾病的發(fā)生率也日益增加[1]。目前對各類肝臟疾病篩查主要通過肝炎病毒標志物檢測、自身免疫性抗體檢測和肝臟酶學(xué)指標檢測等方法[2]。這些方法只能初步判斷肝臟的基本病變，確切診斷結(jié)果往往需要依靠肝臟穿刺病理學(xué)組織檢查。免疫組化檢測在其中占有重要地位，對于肝臟疾病的確診及鑒別診斷具有重要意義。CK7和CK19是人體肝臟中卵圓細胞或肝臟干細胞的高表達標志物，被廣泛應(yīng)用于膽管細胞標記[3-4]?，F(xiàn)將近年來收集的肝臟穿刺病例進行CK7和CK19免疫組化檢測，探討CK7和CK19在肝臟穿刺活檢病理診斷中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2014年1月至2018年12月昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室肝臟穿刺活檢病例標本。

1.2 納入及診斷標準

1.2.1 納入標準（1）乙肝納入標準[5]：肝臟穿刺活檢有炎癥表現(xiàn)，免疫組化檢查乙型肝炎表面抗原陽性；（2）不明原因肝炎納入標準：除外乙肝、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎；（3）PBC納入標準[6]：①血清ALP（堿性磷酸酶）至少大于2UNL或GGT（谷氨酸激酶）至少大于5UNL；②血清AMA（抗線粒體抗體）陽性；③肝組織穿刺活檢顯示匯管區(qū)膽管損傷；（4）PBC-AIH納入標準：至少有兩項標準分別符合PBC和AIH的診斷。

1.2.2 診斷標準（1）PBC診斷標準同納入標準；（2）AIH診斷標準[7]：①ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）至少大于5 UNL；②血清IgG至少大于2 UNL或SMA（抗平滑肌激動蛋白抗體）陽性；③肝臟穿刺活檢顯示中至重度的界面炎，小葉內(nèi)炎癥重。

1.3 研究方法

1.3.1 HE染色 脫蠟至水-蘇木素染色-伊紅染色-中性樹膠封片。

1.3.2 免疫組化染色 切片脫蠟至水-抗原修復(fù)-抗孵育-二抗孵育-DAB顯色-中性樹膠封片。染色過程中所需試劑盒及HBsAg單克隆抗體、CK7單克隆抗體、CK19單克隆抗體均購自福州邁新公司。

1.3.3 結(jié)果判定 采用半定量法判斷結(jié)果，分別對陽性細胞所占的百分比和染色強度給予評分[8]。陽性細胞所占百分比：＜5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分。陽性細胞染色強度：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。最后兩項計分相乘：0分為陰性（-）表達，1～4分為弱陽性（+）表達，5～8分為陽性（++）表達，9～12分為強陽性（+++）表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。連續(xù)型變量采用均數(shù)±標準差（）表示。連續(xù)型變量資料組間比較采用單因素方差分析；分類變量資料組間比較采用完全隨機設(shè)計行×列表資料χ2檢驗和非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗。分類變量資料組內(nèi)比較采用配對χ2檢驗（McNemar檢驗）和配對秩和檢驗。采用雙側(cè)檢驗，檢驗標準α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

共收集238例肝病病例，包括乙肝組37例，不明原因肝炎組93例，PBC組89例和PBC-AIH組19例。四組肝病病例的性別、年齡差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 238例肝病病例的基本臨床特征（）Tab.1 Basic clinical features of 238 cases of liver disease（）

表1 238例肝病病例的基本臨床特征（）Tab.1 Basic clinical features of 238 cases of liver disease（）

2.2 四組肝病病例的病理表現(xiàn)

2.2.1 乙肝 是最常見的肝臟病理類型。肝臟穿刺活檢有不同程度肝細胞水腫、變性、壞死等炎性表現(xiàn)，免疫組化檢查HBsAg（乙型肝炎表面抗原）陽性，見圖1A。

2.2.2 不明原因肝炎 肝臟穿刺活檢有不同程度肝細胞水腫、變性、壞死等炎性表現(xiàn)，排除乙肝、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎，見圖1B。

2.2.3 PBC肝臟穿刺活檢主要表現(xiàn)為慢性、進行性肝內(nèi)膽汁淤積，以肝內(nèi)中小膽管非化膿性肉芽腫性炎癥為特征，見圖1C。

2.2.4 PBC-AIH兼有AIH（自身免疫性肝炎）和PBC兩者的臨床和病理學(xué)特點，主要組織病理學(xué)特征為：中至重度界面炎、肝細胞腫脹或嗜酸性壞死，彌漫性炎細胞浸潤，見圖1D。

圖1 四組肝病病例Fig.1 Liver disease cases in four groups

2.3 四組肝病病例的CK7、CK19免疫組化染色結(jié)果

2.3.1 四組肝病病例的CK7免疫組化染色結(jié)果CK7主要表達于炎癥區(qū)域的病變膽管上皮細胞和淤膽肝細胞，在乙肝、不明原因肝炎、PBC及PBC-AIH中表達部位無明顯差異，見圖2。

2.3.2 四組肝病病例的CK7免疫組化染色結(jié)果CK19主要表達于炎癥部位的膽管上皮細胞，在4組肝病病例中表達部位無明顯差異，見圖3。

圖2 四組肝病病例的CK7表達（SP×100）Fig.2 Expression of CK7 in four-group liver disease cases（SP×100）

圖3 四組肝病病例的CK19表達Fig.3 Expression of CK19 in four-group liver disease cases

2.4 CK7和CK19免疫組化染色的半定量分析結(jié)果

四組肝病病例的CK7和CK19的免疫組化半定量分析結(jié)果如表2所示。其中，CK7和CK19的表達強度比較采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗，結(jié)果顯示四組肝病病例的CK7和CK19的表達強度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明四組肝病病例肝組織內(nèi)CK7、CK19表達強度不全相同；CK7和CK19的表達陽性率比較采用完全隨機設(shè)計行×列表資料的χ2檢驗，結(jié)果顯示CK7和CK19的表達陽性率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明四組肝病病例肝組織內(nèi)CK7、CK19表達陽性率不全相同。

2.5 四組肝病病例CK7和CK19免疫組化染色結(jié)果組內(nèi)比較

2.5.1 CK7與CK19陽性率比較 將各組內(nèi)CK7與CK19表達陽性率進行比較，McNemar檢驗結(jié)果顯示除PBC-AIH組外，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），CK7表達陽性率較高，見表3。

表2 238例肝病病例CK7與CK19表達情況（n）Tab.2 CK7 and CK19 expression in 238 cases of liver diseases（n）

表3 CK7與CK19表達陽性率組內(nèi)比較Tab.3 A comparison of CK7 and CK19 positive expression rates in the groups

2.5.2 CK7與CK19表達強度比較 將各組內(nèi)CK7與CK19表達強度進行比較，結(jié)果顯示CK7表達強度較CK19高，各組CK7與CK19表達強度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

2.6 四組肝病病例CK7和CK19免疫組化結(jié)果組間比較

2.6.1 CK7陽性率組間比較 根據(jù)表2得知四組肝病病例的CK7表達陽性率不全相同，進一步對CK7陽性率進行組間兩兩比較。結(jié)果顯示不明原因肝炎組與PBC組的CK7表達陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余組間比較CK7陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

表4 CK7與CK19表達強度組內(nèi)比較（n）Tab.4 Comparisons of CK7 and CK19 expression intensity in the groups（n）

表5 CK7表達陽性率組間比較Tab.5 Comparisons of CK7 expression positive rates in the groups

2.6.2 CK7表達強度組間比較 根據(jù)表2得知四組肝病病例的CK7表達強度不全相同，進一步對CK7表達強度進行組間兩兩比較。結(jié)果顯示不明原因肝炎組與PBC組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余組間比較CK7表達強度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表6。

2.6.3 CK19陽性率組間比較 根據(jù)表2得知四組肝病病例的CK7表達陽性率不全相同，進一步對CK7陽性率進行組間兩兩比較。結(jié)果顯示不明原因肝炎組與PBC-AIH組及PBC組與PBC-AIH組CK19陽性率相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其他組間比較CK19陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表7。

2.6.4 CK19表達強度差異組間比較 根據(jù)表2得知四組肝病病例的CK19表達強度不全相同，進一步對CK19表達強度進行組間兩兩比較，結(jié)果顯示不明原因肝炎組與PBC-AIH組及PBC組與PBC-AIH組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其他組間比較CK19表達強度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表8。

表6 CK7表達強度組間比較Tab.6 Comparisons of CK7 expression intensity in the groups

表7 CK19表達陽性率組間比較Tab.7 Comparisons of CK19 expression positive rate in the groups

表8 CK19表達強度組間比較Tab.8 Comparisons of CK19 expression intensity in the groups

3 討論

本研究對四組肝臟疾病共238例肝臟穿刺樣本進行了CK7和CK19免疫組化染色，結(jié)果顯示CK7主要表達于膽管上皮細胞和淤膽的肝細胞（圖2）；CK19主要表達于膽管上皮細胞（圖3）。在238例中，乙肝組37例，CK7陽性28例、陰性9例，陽性率75.7%；CK19陽性3例、陰性34例，陽性率8.1%。不明原因肝炎組93例，CK7陽性65例、陰性28例，陽性率69.9%；CK19陽性29例、陰性64例，陽性率31.2%。PBC組89例，CK7陽性80例、陰性9例，陽性率89.9%；CK19陽性50例、陰性49例，陽性率56.2%；PBC-AIH組19例，CK7陽性15例、陰性4例，陽性率78.9%；CK19陽性9例、陰性10例，陽性率47.4%。

在四組肝病病例中，CK7和CK19在PBC中的陽性率最高，提示CK7和CK19檢測可能有助于PBC的臨床診斷。目前PBC臨床診斷主要依據(jù)血清AMA陽性和肝臟穿刺活檢顯示肝內(nèi)膽汁淤積、中小膽管增生及肉芽腫形成等非化膿性炎性病變[9]。本實驗免疫組化結(jié)果顯示，CK7和CK19可表達于PCB時增生的膽管上皮細胞（圖2C、圖3C），為PBC患者肝臟病變的典型特征之一。因此，CK7和CK19免疫組化檢測對PBC的臨床診斷具有輔助價值。另外，有研究者將PBC患者肝臟樣本的CK7免疫組化染色結(jié)果與HE染色結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)CK7免疫組化染色可以觀察到更多被慢性炎癥細胞隱藏的膽管[10]。對比本研究的PBC HE染色（圖1C）與免疫組化染色（圖2C、圖3C）結(jié)果，也可發(fā)現(xiàn)CK7和CK19染色比HE染色能夠更清晰地顯示膽管病變，提示CK7、CK19，尤其CK7免疫組化檢測比依靠常規(guī)HE診斷PBC的敏感性更高。

另外，本實驗進行了四組肝臟疾病的CK7和CK19免疫組化染色陽性率及表達強度差異的組內(nèi)和組間比較。組內(nèi)比較結(jié)果顯示：除PBC-AIH外，各組CK7陽性率比CK19陽性率較高（表3），且四組CK7表達強度均比CK19更高（表4），提示CK7檢測對肝病病例的診斷敏感性具高，其檢測可能比CK19更有意義。組間比較結(jié)果顯示：CK7陽性率及表達強度僅在乙肝組與PBC、不明原因肝炎組與PBC組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表5、表6）；CK19陽性率及表達強度在不明原因肝炎組與PBC-AIH組及PBC組與PBC-AIH組無明顯差異，其余組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表7、表8）。綜合組間比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK7和CK19免疫組化染色在乙肝與PBC、不明原因肝炎組與PBC組表達陽性率和表達強度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而在PBC組與PBC-AIH組均無差異。因此，CK7和CK19檢測可能對乙肝與PBC、及不明原因肝炎與PBC的鑒別診斷具有一定的臨床意義，而不能作為PBC與PBC-AIH的鑒別指標。由于本研究中PBC-AIH例數(shù)較少，具有一定的局限性，尚需擴大樣本量進一步實驗證實CK7、CK19在PBC與PBC-AIH中的表達差異。

CK7和CK19作為重要的免疫學(xué)指標近年來被廣泛應(yīng)用于肝臟病理研究[11－12]。有研究報道[13]，CK19陽性是肝細胞癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的預(yù)測指標；還有研究表明[14]，CK7和CK19在細膽管癌中幾乎均為陽性。因此，CK7、CK19作為重要的膽管細胞標志物對各類肝臟疾病的鑒別診斷具有重要意義，需進一步研究。

綜上所述，CK7主要表達于膽管上皮細胞和淤膽的肝細胞，CK19主要表達于膽管上皮細胞。肝穿組織CK7和CK19免疫組化染色對肝臟病變，尤其PBC的病理學(xué)診斷具有輔助價值。除常規(guī)HE、網(wǎng)狀纖維染色和膠原纖維染色外，建議將CK7和CK19作為病理學(xué)檢測指標應(yīng)用于肝穿組織的檢測。