劉宏偉，姚建輝，劉鵬軍，李衛(wèi)民

（1）榆林市第一醫(yī)院急診科；2）重癥醫(yī)學(xué)科，陜西榆林 719000）

缺血性腦卒中是急重癥醫(yī)學(xué)科室常見病之一，是非創(chuàng)傷性殘疾的主要原因，也是世界第二大死亡原因[1]。缺血性腦卒中由于腦的供血動脈（頸動脈和椎動脈）狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死性疾病，可造成患者永久喪失勞動力，嚴(yán)重影響人們的生活和健康。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子介導(dǎo)大量炎性因子釋放造成神經(jīng)干細(xì)胞炎性反應(yīng)以及非正常凋亡是促進(jìn)缺血性腦卒中發(fā)展的主要原因之一[2]。因此，深入探討調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，是有效緩解缺血性腦卒中進(jìn)展的主要手段。研究表明，miRNA參與調(diào)控缺血性腦卒中引起的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)[3]，其中，miR-145在缺血性腦卒中后表達(dá)下調(diào)，高表達(dá)時(shí)能抑制神經(jīng)干細(xì)胞凋亡緩解缺血性腦卒中的進(jìn)展[4]。程序性細(xì)胞死亡因子4（Programmed cell death 4；PDCD4）在缺血性腦卒中后高表達(dá)，并加重缺血性腦卒中的損傷程度[5]，同時(shí)PDCD4在近年研究中發(fā)現(xiàn)能參與調(diào)控細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)[6]。但目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-145通過調(diào)控PDCD4參與缺血性腦卒中引起的神經(jīng)干細(xì)胞炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。因此，本研究將重點(diǎn)探討miR-145靶向作用PDCD4調(diào)控缺血性腦卒中引起的NE-4C細(xì)胞炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，為今后臨床治療缺血性腦卒中的研究提供一定參考方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

小鼠神經(jīng)干細(xì)胞NE-4C（貨 號：BNCC341769）購買于BeNaCulture，胎牛血清（貨號：10270106）和DMEM（貨號；10566024）培養(yǎng)基購買于Gibco；SYBR Green qPCR（貨號：K0252）、First Strand cDNA Synthesis Kit（貨號：K1612）和凋亡試劑盒（貨號：V13242）均購買于Thermo Fisher公 司；miR-145 mimics/ inhibitor由Gene Pharma公司構(gòu)建；pmirGLO luciferase Target Expression Vector和雙熒光素酶報(bào)告基因測試盒（貨號：SLDL-100）購買于PuFei生物；免疫印跡一抗（Anti-PDCD4antibody貨號：ab51495）及二抗均購自Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染及處理

將小鼠神經(jīng)干細(xì)胞NE-4C細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)NE-4C細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)用濃度20μM的H2O2處理NE-4C細(xì)胞后，收集經(jīng)處理過的細(xì)胞，根據(jù)LipofectamineTM2000 Kit轉(zhuǎn)染miR-145 mimics、sh-PDCD4、miR-145inhibitor，48 h后觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.3 RT-qPCR檢測miRNAs、IL-1β、IL-6和TNF-α 的表達(dá)

離心收集各組細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取各組經(jīng)處理過細(xì)胞的總RNA，在測定濃度后，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)SYBR Green qPCR試劑盒說明書，以U6和GAPDH為內(nèi)參，檢測各組NE-4C細(xì)胞目標(biāo)miRNA或mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行擴(kuò)增，以95℃5 min，94℃30 s，60 ℃30 s為反應(yīng)條件進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，采用公式2-△△Ct計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)量。其中引物序列，見表1。

1.4 Western blot檢測PDCD4蛋白的表達(dá)

收集經(jīng)處理過的細(xì)胞，裂解液提取總蛋白后Bio-Rad DC蛋白質(zhì)測定法檢測純度及濃度，采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白條帶，半干法轉(zhuǎn)膜將條帶轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用以下稀釋過的一抗（Anti-PDCD4antibody 1:1 500）在4℃條件下過夜孵育；棄去一抗洗膜緩沖液洗滌后，加入稀釋好的二抗（1:2 000）避光1h后采用顯色液進(jìn)行顯色，凝膠成像儀曝光觀察并拍照，最后采用Image J對蛋白條帶灰度進(jìn)行定量分析。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR－145與PDCD4的調(diào)控關(guān)系

將含有PDCD4 3'UTR野生型（WT）或突變體（MUT）片段與miR145結(jié)合位點(diǎn)的序列插入pmir-GLO luciferase Target Expression Vector中構(gòu)建mirGLO-PDCD4-WT/MUT熒光素酶報(bào)告載體，使用Lipofectamine將載體和對照組轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，雙熒光素酶報(bào)告基因測試盒檢測熒光素酶活性。

1.6 Annexin-V-FITC實(shí)驗(yàn)檢測NE-4C細(xì)胞凋亡水平

收集處于對數(shù)生長期經(jīng)處理的NE-4C細(xì)胞，PBS清洗3次，離心棄上清，將NE-4C細(xì)胞與預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液、5μL Annexin V-FITC和5μL PI均勻混合后避光孵育10 min，上機(jī)檢測NE-4C細(xì)胞凋亡水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS和GraphPad Prism軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和繪圖；以（）表示，其中兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for PCR

2 結(jié)果

2.1 H2O2 處理促進(jìn)NE-4C細(xì)胞凋亡和產(chǎn)生炎性反應(yīng)

RT-qPCR檢測結(jié)果表明，使用H2O2處理后，IL-1β、IL-6及TNF-α 的表達(dá)水平高于未處理組（P＜0.01），見圖1A。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，與對照組相比，H2O2處理促進(jìn)了NE-4C細(xì)胞凋亡水平（P＜0.01），見圖1B。以上結(jié)果可知，H2O2處理能促進(jìn)NE-4C細(xì)胞凋亡和產(chǎn)生炎性反應(yīng)。

圖1 H2O2 處理促進(jìn)NE-4C細(xì)胞凋亡和產(chǎn)生炎性反應(yīng)Fig.1 H2O2 treatment promotes apoptosis and inflammatory response in NE-4C cells

2.2 H2O2 處理下調(diào)NE-4C細(xì)胞中miR-145的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果表明，與未處理組相比，在H2O2處理的NE-4C細(xì)胞中miR-19a、miR-130、miR-145以及miR-224-3p表達(dá)均下調(diào)（P＜0.05），其中miR-145表達(dá)水平最低（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，異常低表達(dá)的miR-145可能與NE-4C細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)有關(guān)，見圖2。

圖2 H2O2 處理下調(diào)NE-4C細(xì)胞中miR-145的表達(dá)Fig.2 H2O2 treatment down-regulates the expression of miR-145 in NE-4C cells

2.3 過表達(dá)miR-145抑制H2O2 誘導(dǎo)NE-4C細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)

RT-qPCR結(jié)果表明，與NC和H2O2處理組相比，過表達(dá)miR-145顯著上調(diào)了NE-4C細(xì)胞miR-145的表達(dá)水平（P＜0.01），圖3A；同時(shí)RT-qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC和H2O2處理組相比相比，過表達(dá)miR-145并采用H2O2處理后顯著下調(diào)了IL-1β、IL-6及TNF-α 的表達(dá)（P＜0.01），圖3B；而只采用H2O2處理與NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，與NC和H2O處理2組相比，過表達(dá)miR-145并采用H2O2處理顯著抑制了H2O2誘導(dǎo)的NE-4C細(xì)胞凋亡（P＜0.01），圖3C。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，過表達(dá)miR-145緩解H2O2誘導(dǎo)NE-4C細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)。

2.4 miR-145靶向下調(diào)PDCD4的表達(dá)水平

通 過 Microrna（www.microrna.org/microrna/home.do）數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDCD4是miR-145的潛在靶基因，見圖4A。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-145顯著抑制PDCD42野生型質(zhì)粒內(nèi)熒光強(qiáng)度（P＜0.01），見圖4B，而突變型質(zhì)粒熒光強(qiáng)度與對照組無顯著差異。同時(shí)，Western blot檢測結(jié)果顯示，在NE-4C細(xì)胞中過表達(dá)miR-145顯著抑制PDCD4的表達(dá)水平（P＜0.01），見圖4C。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR145靶向下調(diào)PDCD4的表達(dá)水平。

圖3 過表達(dá)miR-145抑制H2O2 誘導(dǎo)NE-4C細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)Fig.3 Overexpression of miR-145 inhibits H2O2-induced apoptosis and inflammatory response in NE-4C cells

圖4 mi-R145靶向下調(diào)PDCD4的表達(dá)水平Fig.4 miR-145 targets down-regulation of PDCD4

2.5 miR-145靶向下調(diào)PDCD4抑制H2O2誘導(dǎo)NE-4C細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)

Westernbolt結(jié)果表明，與NC組相比，敲降PDCD4顯著下調(diào)NE-4C細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)水平（P＜0.01），圖5A；而同時(shí)敲降miR-145和PDCD4中PDCD4的表達(dá)水平與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-qPCR結(jié)果表明，與NC組相比，在轉(zhuǎn)染sh-PDCD4的NE-4C細(xì)胞中采用H2O2處理后，IL-1β、IL-6及TNF-α 的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），圖5B，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor和sh-PDCD4與NC組無顯著差異。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，與NC組相比，轉(zhuǎn)染sh-PDCD4能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的NE-4C細(xì)胞凋亡（P＜0.05），圖5C，在回復(fù)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor和sh-PDCD4中細(xì)胞凋亡水平與NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR145靶向下調(diào)PDCD4抑制H2O2誘導(dǎo)NE-4C細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)。

圖5 miR145靶向下調(diào)PDCD4抑制H2O2 誘導(dǎo)NE-4C細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)Fig.5 Own-regulation of PDCD4 by miR145 inhibits H2O2-induced apoptosis and inflammatory response in NE-4C cells

3 討論

缺血性腦卒中是導(dǎo)致我國居民發(fā)生腦部并發(fā)癥及死亡的主要原因，大約有30%的腦卒中患者永久喪失勞動力[7-8]。近年來研究證實(shí)，腦部供血動脈狹窄或閉塞，造成腦供血不足導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞等發(fā)生非正常凋亡以及分泌炎性因子（如IL-1家族、IL-6、TNF-α 等）進(jìn)一步導(dǎo)致腦組織發(fā)生炎癥和壞死[9]，進(jìn)而造成缺血性腦卒中進(jìn)一步發(fā)展[10]。本研究采用H2O2處理小鼠神經(jīng)干細(xì)胞NE-4C構(gòu)建腦卒中細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α 水平顯著增加，NE-4C細(xì)胞凋亡水平也顯著上升。

近年來，研究證實(shí)，許多非編碼內(nèi)源性小RNA（miRNA）在缺血性腦卒中后表達(dá)發(fā)生變化[11]，并在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控缺血性腦卒中的發(fā)展進(jìn)程，此外，也有研究證實(shí)miRNA在神經(jīng)干細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，如下調(diào)miR-19a抑制神經(jīng)干細(xì)胞凋亡緩解缺血性腦卒中的進(jìn)展[12]；高表達(dá)miR-195能抑制神經(jīng)干細(xì)胞炎性相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF-α 等的分泌進(jìn)而保護(hù)缺血性腦卒中引起的腦損傷[13]。miR-145位于5號染色體5q32-33，是一類腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，miR-145在缺血性腦卒中過程中低表達(dá)，并發(fā)揮重要調(diào)控作用，如上調(diào)miR-145通過調(diào)控MAPK途徑在缺血性腦卒中保護(hù)神經(jīng)干細(xì)胞[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-145在H2O2處理的NE-4C細(xì)胞中表達(dá)水平顯著下調(diào)，過表達(dá)miR-145能顯著下調(diào)H2O2引起的炎性相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)，并抑制NE-4C細(xì)胞的凋亡。

PDCD4是一類細(xì)胞死亡因子，其主要作用可通過MA-3片斷與靶基因的mRNA編碼區(qū)結(jié)合阻斷翻譯過程，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為[15]，同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)PDCD4能抑制抗炎因子IL-10的翻譯，導(dǎo)致IL-10表達(dá)降低，促進(jìn)IL-6等炎性因子分泌從而介導(dǎo)炎癥發(fā)生[16-17]，在腫瘤、肥胖、心血管疾病發(fā)生發(fā)展中參與重要調(diào)控[18-20]。在缺血性腦卒中發(fā)展中，PDCD4上調(diào)并促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞NE-4C的凋亡。本研究通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)PDCD4是miR-145潛在靶基因，miR-145可通過靶向PDCD4，進(jìn)而抑制H2O2引起的NE-4C細(xì)胞炎性相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)和細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究通過NE-4C細(xì)胞發(fā)現(xiàn)并證實(shí)miR-145靶向下調(diào)PDCD4可緩解缺血性腦卒中引起的神經(jīng)干細(xì)胞NE-4C凋亡和炎性反應(yīng)。