陳子若， 楊 庭， 余麗麗， 吳慶偉， 李亞?wèn)|， 邱福南， 雷 棽， 黃 毅

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種惡性程度極高的腫瘤，由于起病較為隱匿且臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，導(dǎo)致許多患者失去了最佳的治療時(shí)機(jī)[1]。福建省為HCC高發(fā)省份，HCC死亡率在各類癌癥居于首位[2]。目前臨床上用于HCC的常規(guī)血清腫瘤標(biāo)志物為抗原類標(biāo)志物甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)。AFP檢測(cè)對(duì)于HCC的及時(shí)診斷與治療具有重要意義，但存在一定程度假陽(yáng)性與假陰性的問(wèn)題[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展時(shí)，由于機(jī)體免疫狀態(tài)的變化，患者體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生針對(duì)自體腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigens，TAAs)的免疫反應(yīng)[5]，對(duì)TAAs信號(hào)起放大作用。因此，通過(guò)檢測(cè)外周血抗TAAs抗體可以有效區(qū)分癌癥患者與正常人，尤其有助于癌前階段患者的發(fā)現(xiàn)[6]。

研究表明，p53在HCC患者血清存在針對(duì)p53的自身抗體，開展血清抗p53抗體的檢測(cè)有助于HCC的診斷[7]。鑒于自身抗體在腫瘤診斷的明顯優(yōu)勢(shì)，筆者擬通過(guò)構(gòu)建的ELISA法與電化學(xué)發(fā)光法分別檢測(cè)50例HCC患者、50例肝臟良性病變(liver benign lesions，LBL)患者、50例健康對(duì)照(healthy control，HC)的血清抗p53抗體及AFP，研究抗p53抗體單獨(dú)檢測(cè)以及與AFP聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC的診斷性能，探討抗p53抗體對(duì)HCC的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 HCC組：收集2017年9月—2018年3月在筆者醫(yī)院住院的HCC患者50例，男性36例，女性14例，年齡(51.2±11.6)歲(31～78歲)，均經(jīng)過(guò)病理學(xué)和(或)病理細(xì)胞學(xué)確診，采血前未接受過(guò)任何抗癌治療。其中乙肝表面抗原陽(yáng)性46例，陰性4例；肝硬化42例，無(wú)8例；腫瘤分化程度：低分化9例，中分化38例，高分化3例；腫瘤直徑：<5 cm 27例，≥5 cm 23例；肝外轉(zhuǎn)移：有11例，無(wú)39例。LBL組：同期診治的LBL患者50例，男性39例，女性11例，年齡(54.3±13.6)歲(26～72歲)，包括血管瘤11例，肝炎20例，肝硬化19例。HC組來(lái)自筆者醫(yī)院體檢中心的健康體檢成人50例，男性33例，女性17例，年齡(53.7±14.5)歲(27～75歲)。所有受試對(duì)象均采集空腹靜脈血，離心分離出血清待測(cè)。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建間接ELISA法檢測(cè)血清抗p53抗體 以0.5 ng/μL的 p53重組蛋白(酵母系統(tǒng)表達(dá)，帶GST標(biāo)簽蛋白，美國(guó)約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院高通量生物學(xué)中心提供)包被酶標(biāo)孔板(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，100 μL/孔，4 ℃包被過(guò)夜；用含0.2%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌3遍后，3%牛血清白蛋白(美國(guó)Amresco公司)300 μL/孔，37 ℃封閉1 h；PBST洗1遍后，加入1∶500稀釋的血清樣本，100 μL/孔，37 ℃溫育1 h；PBST洗4遍后，加入1∶40 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗人IgG抗體(Jackson immuno公司)，100 μL/孔，37 ℃溫育30 min；PBST洗4遍后，加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和3%過(guò)氧化氫(H2O2)(廈門英科新創(chuàng)公司)各50 μL，37 ℃避光顯色10 min；加入2 mol/L硫酸(H2SO4)(廈門英科新創(chuàng)公司)50 μL終止顯色，通過(guò)酶標(biāo)儀(TECAN公司)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光度(OD)值。以“HC組檢測(cè)OD均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差”作為抗p53抗體陽(yáng)性判斷的Cut-off值。

對(duì)構(gòu)建的間接ELISA法進(jìn)行批內(nèi)與批間精密度的性能評(píng)估。批內(nèi)精密度：低、高兩種水平標(biāo)本在同批次檢測(cè)中重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算其批內(nèi)CV。批間精密度：低、高兩種水平標(biāo)本每天復(fù)孔測(cè)定，連續(xù)測(cè)定20 d，計(jì)算其批間CV。

1.2.2AFP檢測(cè)方法及其陽(yáng)性判斷 在羅氏cobas e602分析儀上采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)各組血清AFP水平(AFP試劑盒購(gòu)自德國(guó)羅氏公司)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。AFP陽(yáng)性以>20 ng/mL為Cut-off值。

2 結(jié) 果

2.1間接ELISA法檢測(cè)抗p53抗體的精密度評(píng)估 低、高兩種水平標(biāo)本檢測(cè)的批內(nèi)CV分別為7.21%和3.03%，均<10%；低、高兩種水平標(biāo)本檢測(cè)的批間CV分別為10.16%和4.79%，均<15%。以上結(jié)果表明構(gòu)建的間接ELISA法對(duì)抗p53抗體具有理想的檢測(cè)精密度。

2.2血清抗p53抗體水平的比較 HCC組血清抗p53抗體水平明顯高于LBL組(P<0.05)和HC組(P<0.01，圖1)。

2.3血清抗p53抗體檢測(cè)陽(yáng)性率的比較 HCC組血清抗p53抗體陽(yáng)性率為36.00%(18/50)，明顯高于LBL組[16.00%(8/50)，(P<0.05)]與HC組[2.00%(1/50),(P<0.01)]。

2.4血清抗p53抗體、AFP單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC診斷敏感性、特異性、準(zhǔn)確度的比較 抗p53抗體和AFP中有一項(xiàng)為陽(yáng)性即視為聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性，以LBL組與HC組作為對(duì)照。結(jié)果顯示，血清抗p53抗體、AFP單獨(dú)檢測(cè)對(duì)HCC診斷的敏感性分別為36.0%及54.0%，特異性分別為91.0%及83.0%；兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC診斷的敏感性為76.0%(特異性80.0%)，明顯高于抗p53抗體的敏感性36.0%(P<0.05，表1)。

表1 抗p53抗體、AFP單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC診斷效能的比較

Tab 1 The diagnostic performances of seperate and combinated detection of anti-p53 and AFP in HCC %

指 標(biāo)敏感性特異性準(zhǔn)確度抗p53抗體36.091.072.7AFP54.083.073.3抗p53抗體+AFP76.0△80.078.7

AFP:甲胎蛋白. 與抗p53抗體比較，△：P<0.05.

2.5ROC曲線分析血清抗p53抗體、AFP單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC的診斷價(jià)值 抗p53抗體、AFP單獨(dú)檢測(cè)對(duì)HCC診斷的AUC分別為0.630(95%CI0.547～0.707)和0.685(95%CI0.604～0.758)；兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC診斷的AUC達(dá)0.770(95%CI0.694～0.835)(圖2)。

3 討 論

目前，HCC的診斷主要根據(jù)影像學(xué)、肝組織活檢、血清學(xué)標(biāo)志物。傳統(tǒng)的超聲、CT及MRI等影像學(xué)檢查手段對(duì)病變體積微小的肝癌如小肝癌(≤1 cm)容易漏檢，存在難以避免的盲區(qū)。肝組織活檢結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是取樣受限較多，患者常常不易接受。相比而言，血清學(xué)檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，且在影像學(xué)發(fā)現(xiàn)之前，血清學(xué)標(biāo)志物常有異常表達(dá)，可以對(duì)腫瘤起到監(jiān)測(cè)和預(yù)警的作用。目前臨床應(yīng)用的血清腫瘤標(biāo)志物均為抗原類標(biāo)志物，其中以AFP在HCC的應(yīng)用最為廣泛，但其診斷的特異性與敏感性均有待改善，表現(xiàn)為約1/3慢性肝病、肝纖維化以及肝硬化患者可出現(xiàn)血清AFP水平不同程度的升高，而在HCC患者中AFP陰性或低濃度的比例達(dá)1/3，容易導(dǎo)致HCC患者的漏診[8]。近年來(lái)的研究表明，TAAs相關(guān)自身抗體的檢測(cè)有望為腫瘤的診斷開辟出一條新途徑[9]。在疾病發(fā)展早期TAAs水平較低不能被常規(guī)方法所檢測(cè)到時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)就能識(shí)別并產(chǎn)生針對(duì)TAAs的大量抗體，因此與抗原類標(biāo)志物檢測(cè)相比，TAAs相關(guān)自身抗體在腫瘤的早期具有更高的敏感性；其次，產(chǎn)生的TAAs相關(guān)自身抗體半衰期長(zhǎng)，能穩(wěn)定存在于血清中相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間，易于臨床檢測(cè)[10]。

作為一種公認(rèn)的抑癌基因，p53參與細(xì)胞周期、凋亡、衰老、DNA修復(fù)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[11-12]，在多種腫瘤(包括HCC)中存在突變、過(guò)表達(dá)等方面的異常改變[13]。針對(duì)p53的血清自身抗體與HCC的關(guān)系已經(jīng)引發(fā)了關(guān)注。胡德海等開展的一項(xiàng)研究表明血清抗p53抗體在HCC患者的血清中存在高表達(dá)，敏感性達(dá)39.1%(18/46)[14]。國(guó)外學(xué)者報(bào)道，抗p53抗體在非乙非丙型HCC患者血清中的陽(yáng)性率高達(dá)91.52%(特異性84.63%)，且與AFP含量、腫瘤大小、疾病分期、MELD積分、Child-Pugh積分之間呈正相關(guān)[15]。以上研究結(jié)果表明，血清抗p53抗體的檢測(cè)有助于HCC的診斷，是否抗p53抗體與AFP的聯(lián)合檢測(cè)有助于提高對(duì)HCC的診斷效能值得探討。

本研究通過(guò)構(gòu)建的ELISA法與電化學(xué)發(fā)光法分別檢測(cè)50例HCC、50例LBL、50例HC的血清抗p53抗體與AFP，研究抗p53抗體單獨(dú)檢測(cè)以及與AFP聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC的診斷性能，結(jié)果顯示，HCC組血清抗p53抗體和AFP的水平均明顯高于LBL組(P<0.05)和HC組(P<0.01)，其中抗p53抗體對(duì)HCC的敏感性為36.0%，特異性為91.0%，AUC為0.630(95%CI0.547～0.707)；AFP對(duì)HCC的診斷敏感性為54.0%，特異性為83.0%，AUC為0.685(95%CI0.604～0.758)。將抗p53抗體與AFP聯(lián)合檢測(cè)，可將對(duì)HCC的敏感性明顯提高至76.0%(特異性80.0%)，AUC提高至0.770(95%CI0.694～0.835)。以上研究結(jié)果表明，抗p53抗體對(duì)HCC具有理想的診斷價(jià)值；抗p53抗體與AFP具有互補(bǔ)性，兩者的聯(lián)合檢測(cè)有助于進(jìn)一步提高對(duì)HCC的診斷效能(在保證特異性的前提下，提高敏感性)。鑒于本研究尚屬小樣本的研究，抗p53抗體與AFP聯(lián)合檢測(cè)在改進(jìn)HCC患者的血清學(xué)篩查質(zhì)量的臨床價(jià)值和意義還有待后續(xù)大樣本、多中心的進(jìn)一步驗(yàn)證。