李小蓉，郭 惠，閆 浩，李 治，劉江濤，徐韻怡

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 西安 712046)

圖1 蘆丁的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of rutin

蘆丁是一種主要存在于蕓香葉、煙草、蕎麥、槐樹蕾等植物中的黃酮類化合物(結(jié)構(gòu)式如圖1)，具有抗炎[1]、抗氧化[2]、清除超氧化物自由基、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤等作用，在加強(qiáng)毛細(xì)血管彈性、改善人體循環(huán)等方面也具有突出效果。因此，含有蘆丁的中藥材及其制劑在日常生活中的應(yīng)用越來越廣泛，成為人們緩解或治愈病痛的首選。由于中藥材的質(zhì)量易受產(chǎn)地、栽培、采收、貯存、加工等因素而變得良莠不齊，檢測中藥材及其制劑中的蘆丁含量以保證其藥用價值就顯得尤為重要。因此，建立快速、簡便、靈敏度高的蘆丁含量的分析方法具有重要意義。目前，蘆丁測定的方法主要有高效液相色譜法[3-4]、毛細(xì)管電泳法[5]、電化學(xué)分析法[6]和熒光分析法[7]等。其中，電化學(xué)分析法具有樣品前處理簡單、響應(yīng)速度快、檢測成本低、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，在中藥有效成分的檢測方面得到了廣泛應(yīng)用[8-10]。

有關(guān)蘆丁電化學(xué)傳感器的研究也取得了一定進(jìn)展，主要是采用新材料或新方法提高檢測靈敏度及方法選擇性，所用材料主要有鈀[11]、碳納米管[12]、金[13]、二氧化鈦[14]等納米材料。如張敏等[11]將鈀-金復(fù)合納米溶膠滴在玻碳電極(GCE)表面，制作了一種新型蘆丁電化學(xué)傳感器，該傳感器對蘆丁的電化學(xué)氧化具有顯著的催化作用，實(shí)現(xiàn)了蘆丁的電化學(xué)檢測，檢出限為1.0×10-7mol/L。尚永輝等[12]采用多壁碳納米管(MWNTs)修飾碳糊電極研究了蘆丁的電化學(xué)行為，對其進(jìn)行了電化學(xué)檢測，并在此基礎(chǔ)上研究了蘆丁與DNA的相互作用。

碳納米管導(dǎo)電性能優(yōu)良，對小分子物質(zhì)具有較好的催化作用，在電化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[15-16]。大量研究表明，當(dāng)碳納米管與其他納米材料復(fù)合時，兩者可能存在協(xié)同作用，制得的電極材料具有更加優(yōu)良的性能[17-19]。金屬納米材料在電化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用也較多，常見的有貴金屬納米(Au、Ag、Pt等)材料以及過渡金屬納米(如Cu、Pb、Ni等)材料。而過渡金屬Cu由于價格低廉，導(dǎo)電性好，物質(zhì)擴(kuò)散極快，在某些方面比貴金屬具有更高的氧化電勢，呈現(xiàn)潛在的催化優(yōu)勢[20-21]。本研究采用多壁碳納米管(MWNTs)和納米銅復(fù)合材料修飾玻碳電極構(gòu)建電化學(xué)傳感器，建立了一種簡單、高靈敏檢測蘆丁含量的新方法，并應(yīng)用于中藥槐米中蘆丁含量的測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；pHS-3C型pH計(jì)(上海日島科學(xué)儀器有限公司)；SG8200H型超聲波清洗機(jī)(上海冠特超聲儀器有限公司)；實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)的三電極體系:裸GCE(玻碳電極)(直徑3 mm)及不同材料修飾的GCE為工作電極，鉑片為輔助電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。

蘆丁對照品(純度≥98%，北京索萊寶生物科技有限公司)；Nafion(0.5%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液，美國Aldrich公司)；MWNTs(99%，中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司)，鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀(分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；硫酸銅(分析純，成都市科龍化工試劑廠)；槐米(陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司)；其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合材料修飾電極的構(gòu)建將GCE在麂皮上用0.5 μm的Al2O3拋光至光亮，用二次蒸餾水洗凈，晾干備用。精密稱取2.0 mg MWNTs于1 mL 0.5% Nafion溶液中，混合均勻后，室溫下于70 kHz超聲90 min至溶液透黑均勻且無顆粒，即得2 mg/mL的MWNTs-Nafion分散液。精密移取5 μL分散液，滴涂在打磨好的GCE表面，自然晾干。然后將該電極浸入含0.05 mol/L CuSO4的H2SO4溶液(pH 2.0)中，采用三電極體系，在-0.4 V電沉積8 s，得GCE/MWNTs/Nafion/Cu修飾電極(構(gòu)建流程見圖2)。

圖2 修飾電極的制備流程Fig.2 Preparation process of the modified electrode

1.2.2 槐米樣品的處理取槐米樣品0.1 g，精密稱定后置于100 mL燒杯中，加入50 mL甲醇，精密稱定質(zhì)量后用保鮮膜密封，超聲處理(250 W，25 kHz) 30 min，將溶液放置冷卻，再稱重，加入甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，將溶液搖勻，濾過，放于具塞錐形瓶中備用。

1.2.3 傳感器的電化學(xué)響應(yīng)測試采用循環(huán)伏安法(CV)和電化學(xué)阻抗譜(EIS)表征修飾電極的電化學(xué)性能。在鐵氰化鉀溶液中CV法掃描范圍為-0.3 ～0.6 V，在蘆丁溶液中的掃描范圍為0.0 ～0.8 V，掃描速率均為0.1 V/s。當(dāng)納米Cu的沉積電位為-0.4 V，沉積時間8 s，緩沖液pH值為3.0以及碳納米管的使用量為5 μL時，在0.6 ～0.3 V范圍內(nèi)記錄差分脈沖伏安(DPV)曲線并讀取還原峰電流值，對蘆丁進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾電極表面形態(tài)表征

采用掃描電鏡(SEM)對修飾電極的形態(tài)進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖3。由GCE/MWNTs/Nafion電極的SEM圖(圖3A)可見，MWNTs呈細(xì)長的管狀，結(jié)構(gòu)緊湊，相互交織地分布在GCE表面，使電極具有較大的表面積，其修飾層中含有的元素主要為C、O和F元素(圖3C)。電沉積納米銅后形成GCE/MWNTs/Nafion/Cu電極，其SEM圖可見電沉積形成的納米銅顆粒大小均勻(圖3B)，通過Nafion牢固地附著在MWNTs表面，且在電極表面分散性良好，使得電極具有更大的表面積，進(jìn)一步改善了電極導(dǎo)電性能，其修飾層含有元素Cu(圖3D)，表明MWNTs和納米銅復(fù)合材修已成功制備。

圖4 鐵氰化鉀在不同電極上的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of [Fe(CN)6]3- on different electrodes a.GCE,b.GCE/Cu,c.GCE/ MWNTs/Nafion,d.GCE/ MWNTs/Nafion/Cu

2.2 修飾電極的電催化活性研究

分別構(gòu)建了裸GCE、GCE/Cu、GCE/MWNTs/Nafion、GCE/MWNTs/Nafion/Cu修飾電極，在1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)電解液中，采用CV法考察鐵氰化鉀的電化學(xué)行為，以表征不同電極的電催化活性(圖4)。結(jié)果顯示，裸GCE的氧化還原峰電流最小(曲線a)；GCE/Cu電極的氧化還原峰電流較裸GCE略大(曲線b)，表明Cu有催化作用，但效果甚微；GCE/MWNTs/Nafion電極上氧化還原峰電流值明顯增加(曲線c)，可見MWNTs比納米銅具有更高的電催化活性和導(dǎo)電性；而在GCE/MWNTs/Nafion/Cu修飾電極上的氧化還原峰電流最大(曲線d)，其還原峰電流約為裸GCE的8倍，GCE/Cu的6倍，GCE/MWNTs/Nafion的2倍，表明該復(fù)合材料修飾電極的電催化活性最高，這可能源于納米材料間的協(xié)同作用所致。

圖5 不同修飾電極的電化學(xué)阻抗譜Fig.5 Electrochemical impedance spectroscopy of different modified electrodes a.GCE,b.GCE/Cu,c.GCE/ MWNTs/Nafion,d.GCE/ MWNTs/Nafion/Cu

圖6 不同電極對蘆丁的循環(huán)伏安響應(yīng)Fig.6 Cyclic voltammograms of different electrodes to rutin a.GCE,b.GCE/Cu,c.GCE/MWNTs/Nafion,d.GCE/ MWNTs/Nafion/Cu

2.3 修飾電極的阻抗表征

EIS可以表征電極的表面特性，進(jìn)而考察電極在溶液中的電子傳遞效率，以研究電極修飾材料的導(dǎo)電性能，EIS圖中半圓直徑越小，表明阻抗越小，即電極在溶液中的電子傳輸速率越快，電極的導(dǎo)電性能越好。圖5為裸GCE、GCE/Cu、GCE/MWNTs/Nafion和GCE/MWNTs/Nafion/Cu 4種電極在5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和5.0 mmol/L K4[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)溶液中的EIS圖，由圖可知，裸GCE的阻抗最大(曲線a)，GCE/Cu修飾電極的阻抗稍小(曲線b)，主要是由于納米銅具有較大的比表面積，改善了GCE的導(dǎo)電性；與GCE/Cu電極相比較，GCE/MWNTs/Nafion電極的阻抗大幅減小(曲線c)，表明MWNTs比納米銅的導(dǎo)電性能更好，而GCE/MWNTs/Nafion/Cu電極的阻抗圖幾乎是一條直線(曲線d)，表明其電子傳輸速率最快，導(dǎo)電性能最優(yōu)，可能是由于復(fù)合納米材料之間存在協(xié)同作用，極大地改善了其電化學(xué)性能，與循環(huán)伏安研究結(jié)果一致。

2.4 蘆丁在不同電極上的電化學(xué)響應(yīng)

實(shí)驗(yàn)研究了1.0×10-5mol/L蘆丁在裸GCE、GCE/Cu、GCE/MWNTs/Nafion和GCE/MWNTs/Nafion/Cu電極表面的電化學(xué)響應(yīng)(圖6)。由圖可見，蘆丁在裸GCE表面于0.45 V左右出現(xiàn)一對氧化還原峰(曲線a)，但峰電流值最小，表明其對蘆丁的響應(yīng)最差；在GCE/Cu電極表面(曲線b)，氧化峰電流(Ipa)和還原峰電流(Ipc)略有增加，但增幅較小，表明納米銅對蘆丁的催化作用較弱；GCE/MWNTs/Nafion電極的峰電流值明顯增加(曲線c)，表明MWNTs對蘆丁較好的催化作用；而在GCE/MWNTs/Nafion/Cu電極上(曲線d)，峰電流值顯著增加，其還原峰電流值約為GCE/MWNTs/Nafion電極的5倍，表明MWNTs和納米銅復(fù)合后，顯著增加了電極的比表面積，電極表面的活性位點(diǎn)進(jìn)一步增加，二者協(xié)同催化蘆丁在電極上的電化學(xué)反應(yīng)。

2.5 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.5.1 緩沖液pH值的選擇以GCE/MWNTs/Nafion/Cu為工作電極，0.1 mol/L PBS緩沖溶液為介質(zhì)，采用CV法考察了不同緩沖溶液pH值對1.0×10-5mol/L蘆丁在電極表面的電化學(xué)響應(yīng)。結(jié)果顯示，當(dāng)緩沖溶液pH值從2.0增至3.0時，蘆丁的還原峰電流值逐漸增加，且在pH 3.0時達(dá)到最大值，繼續(xù)增加緩沖溶液pH值，還原峰電流值反而逐漸減小。因此，選擇PBS緩沖溶液的最佳pH值為3.0。另外，隨著緩沖溶液pH值的增加，體系還原峰電位(Epc)發(fā)生負(fù)移，兩者關(guān)系符合方程Epc=0.589-0.053 pH(r=0.997)，說明電極反應(yīng)過程中有H+參與，再根據(jù)公式Epc=E0-0.059(m/n)pH[22]計(jì)算得m=n，表明蘆丁在該電極表面是一個等電子等質(zhì)子的反應(yīng)過程。

2.5.2 掃描速率的選擇為進(jìn)一步了解蘆丁在GCE/MWNTs/Nafion/Cu電極上的反應(yīng)機(jī)理，以PBS緩沖液(pH 3.0)為介質(zhì)，考察了1.0×10-5mol/L蘆丁在不同掃速(50、100、150、200、250、300、350 mV/s)下的循環(huán)伏安圖。結(jié)果顯示，蘆丁的氧化峰及還原峰電流均隨掃速的增加而逐漸增加，其中氧化峰電位逐漸正移，還原峰電位逐漸負(fù)移，即峰電位差逐漸增大，表明蘆丁在電極表面反應(yīng)的可逆性逐漸變差。綜合考慮峰形和峰電流，選擇0.1 V/s為CV的最佳掃描速率。通過進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在50 ～350 mV/s范圍內(nèi)，蘆丁的還原峰電流(Ipc)與掃描速率的平方根及掃描速度(v,mV/s)成正比，其線性方程分別為Ipc=8.27v1/2-39.76(r=0.997)和Ipc=0.32v+9.48(r=0.998)，表明蘆丁在該修飾電極上的還原過程是受擴(kuò)散和吸附共同控制的電極過程。

2.5.3 沉積電位的選擇由于不同的沉積電位影響納米銅在電極表面的形態(tài)及大小，進(jìn)而影響修飾電極對蘆丁的響應(yīng)，因此對納米銅的沉積電位(-0.25 ～-0.5 V)進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，隨著沉積電位的降低，蘆丁的還原峰電流不斷增加，在-0.4 V時達(dá)到最大；之后繼續(xù)降低沉積電位，還原峰電流反而減小，故選擇-0.4 V為納米Cu的最優(yōu)沉積電位。

2.5.4 沉積時間的選擇納米銅沉積時間影響其在電極表面的厚度，進(jìn)而影響電極的導(dǎo)電性及電子傳遞速度，從而對蘆丁的電化學(xué)信號產(chǎn)生影響，因此，實(shí)驗(yàn)考察了不同沉積時間(4、6、8、10、12 s)下的傳感器對蘆丁的響應(yīng)。結(jié)果顯示，當(dāng)沉積時間由4 s增加到8 s時，蘆丁的還原峰電流值逐漸增加，且在8 s時達(dá)到最大，繼續(xù)增加沉積時間，還原峰電流值反而降低，表明納米銅的厚度偏大，導(dǎo)致修飾電極對蘆丁的響應(yīng)變差。因此，實(shí)驗(yàn)選擇納米Cu最佳沉積時間為8 s。

2.5.5 碳納米管用量的選擇MWNTs具有良好的導(dǎo)電性和較大的表面積，在一定用量范圍內(nèi)可以極大地提高修飾電極對蘆丁的響應(yīng)，但若用量過多，會導(dǎo)致修飾電極的厚度增大，反而降低電子傳遞速率，不利于分析測定，因此，實(shí)驗(yàn)考察了MWNTs用量(2、3、5、7、9 μL)對蘆丁的電化學(xué)響應(yīng)。結(jié)果顯示，當(dāng)MWNTs用量為5 μL時，電流值達(dá)到最大；繼續(xù)增加MWNTs的用量會使還原峰電流值降低，表明此時修飾涂層太厚，阻礙了電子的傳遞，降低了電極的靈敏度。因此實(shí)驗(yàn)選擇MWNTs用量為5 μL。

2.6 蘆丁的測定

在優(yōu)化條件下制備GCE/MWNTs/Nafion/Cu修飾電極，采用DPV法對不同濃度(1.0×10-8、3.0×10-8、5.0×10-8、7.0×10-8、1.0×10-7、5.0×10-7、7.0×10-7、1.0×10-6mol/L)的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，記錄其DPV曲線(圖7A)。由圖可見，在1.0×10-8～1.0×10-6mol/L濃度范圍內(nèi)，還原峰電流(Ipc，μA)隨蘆丁濃度(c，μmol/L)增大而增大，其線性方程為Ipc=11.0c+6.38(r=0.998)(圖7B)，檢出限(S/N=3)為8.4×10-9mol/L。與已報(bào)道的蘆丁傳感器相比較，具有較寬的線性范圍和較高的靈敏度(表1)。這種響應(yīng)不僅是MWNTs和納米銅的簡單疊加，而主要源于顆粒均勻、性能優(yōu)良的納米銅與MWNTs之間具有良好的協(xié)同增效作用，改善了電極表面性能，加快了電子轉(zhuǎn)移速率，從而提高了傳感器的靈敏度。

SensorLinear range(10-7 mol/L)Detection limit(10-7 mol/L)ReferenceGCE/Pd-Au25 ～7501.0[11]CPE/MWCNTs5.0 ～2 0002.0[12]GCE/MWNTs-CHIT/Au4.00 ～1771.29[13]GCE/Au-TiO2-Nafion1 ～1000.83[14]GCE/Poly(Congo red)0.5 ～800.2[23]GCE/MWNTs/Nafion/Cu0.1 ～100.084This work

2.7 電極的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及選擇性

電極重現(xiàn)性及穩(wěn)定性對測量結(jié)果具有重要影響，將制備的復(fù)合材料修飾電極置于PBS緩沖液(pH 6.0)中，用CV法在-0.8 ～0.8 V電位范圍內(nèi)掃描10圈活化，再用DPV法對1.0×10-7mol/L蘆丁重復(fù)測定6次，得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.8%。采用相同方法分別制備3支修飾電極，測定蘆丁(1.0×10-7mol/L)的RSD為2.3%。將電極于室溫下放置15 d，在相同條件測定，發(fā)現(xiàn)蘆丁(1.0×10-7mol/L)，還原峰電流仍能達(dá)到最初的96%，表明所制備的修飾電極有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

由于在實(shí)際應(yīng)用中，樣品測定常會被未知物質(zhì)干擾，進(jìn)而影響測定結(jié)果，因此對傳感器的選擇性進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，當(dāng)電流測量誤差小于5%時，150倍的硝酸根離子、鋅離子、硫酸根離子、鈣離子、鎂離子等無機(jī)離子，100倍的多巴胺(DA)、葡萄糖(C6H12O6)、尿酸(UA)等對蘆丁的測定幾乎無干擾。表明該傳感器抗干擾能力較強(qiáng)，選擇性較好。

2.8 實(shí)際樣品測定

取“1.2.2”制備的樣品溶液10 μL，將其稀釋10 000倍，精密移取10 mL，用DPV法測定蘆丁含量，平行實(shí)驗(yàn)3次，并與藥典的HPLC法進(jìn)行對比。結(jié)果顯示，采用HPLC法測定的蘆丁含量為23.06%，采用本法測定的蘆丁含量為23.28%，表明所制備的修飾電極測定結(jié)果符合2015版藥典規(guī)定的“按干燥品計(jì)算，槐米含無水蘆丁(C27H30O16)不得少于15.0%”。再向其中分別加入4.0×10-7、6.0×10-7、8.0×10-7mol/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用DPV法平行測定3次，得其回收率為98.1% ～101%。表明本方法可用于實(shí)際樣品中蘆丁含量的測定，具有較高的準(zhǔn)確度。

3 結(jié) 論

本文將多壁碳納米管-Nafion滴涂在玻碳電極表面，然后電沉積納米銅，構(gòu)建了一種新型蘆丁電化學(xué)傳感器。該傳感器不僅具有MWNTs和納米銅各自的特點(diǎn)，并且兩者復(fù)合后產(chǎn)生的協(xié)同作用使電極的比表面積更大，電子轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，因此蘆丁在其表面的電化學(xué)活性顯著提高。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，該傳感器對蘆丁的線性范圍為1.0×10-8～1.0×10-6mol/L，檢出限為8.4×10-9mol/L。將其用于槐米中蘆丁含量的測定，回收率為98.1% ～101%，表明該傳感器對蘆丁的檢測具有靈敏度較高、線性范圍較寬、檢出限較低等優(yōu)點(diǎn)，在檢測中藥中蘆丁含量方面具有發(fā)展及應(yīng)用空間，為蘆丁相關(guān)藥物的質(zhì)量監(jiān)控提供了新平臺。