趙旭霞，馮 蕊，郭婭男，鄭速進，張加玲，閻小青

(山西醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院 衛(wèi)生檢驗教研室，山西 太原 030001)

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境的持久性有機污染物，主要來源于煤、石油等有機化合物的不完全燃燒，也會產(chǎn)生于燒烤食物以及瀝青、焦油等的生產(chǎn)過程中。其中，苯并[a]芘(B[a]P)是最為典型的一種多環(huán)芳烴，具有極強的致畸、致癌和致突變性，在進入人體后經(jīng)過一系列代謝活化作用生成鄰二醇環(huán)氧苯并芘(BPDE)[1-3]，此代謝產(chǎn)物有(±)anti-BPDE和(±)syn-BPDE兩對對映異構(gòu)體(anti-BPDE與syn-BPDE之間為非對映異構(gòu)體)。大量的研究表明(±)anti-BPDE比其立體異構(gòu)體(±)syn-BPDE更具誘變性[4-7],(±)anti-BPDE主要與生物體DNA中脫氧鳥苷的N-2位點結(jié)合[1-4]，生成BPDE的脫氧鳥苷加合物(anti-BPDE-N2-dG)。此加合物是化學物質(zhì)致突變、致癌進程中一個重要的啟動因子[8]，既可以作為暴露標志物，反映毒物在靶位的實際暴露劑量，又可以作為效應標志物，反映DNA受到有毒化學物質(zhì)損傷的程度，對研究環(huán)境和職業(yè)B[a]P暴露的早發(fā)現(xiàn)、早預防有重要意義[9-10]。anti-BPDE-N2-dG含有兩個手性碳原子，存在對映異構(gòu)和順反異構(gòu)現(xiàn)象，主要有trans(-)、trans(+)、cis(+)、cis(-)-anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)(如圖1所示)[11]，其中，trans(-)與trans(+)-anti-BPDE-N2-dG，cis(+)與cis(-)-anti-BPDE-N2-dG為兩對對映異構(gòu)體(手性異構(gòu)體)，而trans與cis-anti-BPDE-N2-dG為順反異構(gòu)體。研究表明這四種立體異構(gòu)體的生物學活性存在顯著差異[12]。因此，對anti-BPDE-N2-dG加合物的四種立體異構(gòu)體進行準確地定性和定量分析，對B[a]P暴露監(jiān)測及其致癌、致突變的作用機理研究非常重要。

圖1 anti-BPDE-N2-dG立體異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of anti-BPDE-N2-dG stereoisomers

環(huán)境中多環(huán)芳烴的暴露水平極低，所以暴露后的生物體內(nèi)相應形成的DNA加合物含量更低。大約108～1010個核苷酸中含有1個加合物[4]，如何從大量的正常核苷中檢出痕量的特定加合物是當今分析技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)。目前，關(guān)于苯并芘DNA加合物的檢測發(fā)展了多種方法[13-14]，包括32P標記法、免疫吸附法、核磁共振法、熒光檢測法，但這些方法均無法對加合物的立體異構(gòu)體進行表征。相比之下，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)不僅擁有可與32P后標記法相媲美的靈敏度，而且還可以提供加合物的結(jié)構(gòu)信息，因此受到了更多關(guān)注[15-19]，但在使用該方法定量檢測BPDE-DNA加合物時，需合成相應的標準品。目前，文獻報道了BPDE-DNA加合物的不同合成方法[15-18]，其中，王海林課題組[15]創(chuàng)新性地通過anti-BPDE與2′-脫氧鳥苷(Deoxyguanosine，dG)直接反應后，用固相萃取(SPE)和高效液相色譜(HPLC)對反應產(chǎn)物進行提純制得anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體。該方法與以往的合成方法相比，具有無需酶解、反應時間短、BPDE用量少等優(yōu)點。但該合成方法利用常規(guī)苯基柱需要85～100 min[15]才可將anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體實現(xiàn)色譜分離提純。另外，在利用HPLC-MS/MS對anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體進行檢測時，雖然質(zhì)譜的選擇性監(jiān)測可排除副產(chǎn)物四醇-B[a]P的干擾，縮短色譜分離時間，但仍需45～60 min才能將四種立體異構(gòu)體分離并檢測[18-19]，且流速快，分流檢測使得樣品用量大，分離度較小。

五氟苯基柱(PFP)是在硅膠基質(zhì)上鍵合的五氟苯基硅烷鍵合相，由于五氟苯基的存在，化合物可與鍵合相之間產(chǎn)生π-π共軛、偶極-偶極、氫鍵等作用[20]，因此PFP柱的選擇性有別于C18柱和苯基柱。本研究首次將PFP應用于anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體的分離，結(jié)果表明，相對于常規(guī)C18色譜柱，anti-BPDE-N2-dG 四種立體異構(gòu)體在 PFP色譜柱上的分離效果更好。通過對色譜條件的優(yōu)化，可實現(xiàn)45 min內(nèi)將四種立體異構(gòu)體分離提純。在使用HPLC-MS/MS檢測時，30 min內(nèi)即可完成檢測，極大提高了分離與檢測效率。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜配二極管陣列(DAD)檢測器(Thermo scientific U3000，美國Thermo公司)；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LCMS-8050，日本島津公司)；MOS 450圓二色光譜儀(法國BioLogic公司)；TU-1901雙光束紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；SCIENTZ-12N冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；GI36DS高壓滅菌鍋(廈門致微儀器有限公司)；Mikro 220R高速冷凍離心機(德國Hettich公司)；PB-10 pH計(德國Sartorius公司)；ME104E電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；RCT basic加熱磁力攪拌器(德國IKA集團)。

(±)anti-BPDE(純度>99%，美國MRIGlobal Chemical Carcinogen Repository)；2′脫氧鳥苷(純度98%，百靈威科技有限公司)；小牛胸腺DNA(美國Sigma公司)；脫氧核糖核酸酶Deoxyribonuclease I from bovine pancreas(美國Sigma公司)；蛇毒磷酸二酯酶Phosphodiesterase I from Crotalus adamanteus venom(美國Sigma公司)；Tris-base(上海Sangon Biotech)；四氫呋喃、三乙胺、氯化鈉、氯化鈣、乙醚、無水乙醇、乙酸乙酯、濃鹽酸(分析純，天津市光復精細化工研究所)；六水氯化鎂(上海BBI Life Sciences)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Thermo Fisher公司)；甲酸(色譜純，天津市致遠化學試劑有限公司)；超純水(屈臣氏飲用水)。

1.2 anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體標準品的制備

1.2.1 合成反應及固相萃取的初步純化(±)anti-BPDE與小牛胸腺DNA反應生成BPDE-脫氧鳥苷酸化合物(BPDE adduct of deoxyguanosine monophosphate，BPDE-dGMP)：參照Vouros[21]課題組的方法合成BPDE-dGMP。稱取 0.9 mg(±)anti-BPDE溶于1 mL四氫呋喃；稱取3.6 mg小牛胸腺DNA溶于5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)；將兩者混勻，50 ℃避光孵育8 h。孵育結(jié)束，加乙酸乙酯-乙醚(5∶2，體積比)7 mL液液萃取，收集下層液體，重復3次。加入NaCl使其在溶液中的濃度為0.14 mol/L，搖勻，再加入2.5倍體積的無水乙醇，充分混勻，-22 ℃靜置20～30 min后，-10 ℃ 12 000 r/min離心20 min，移走上清液，室溫下干燥，復溶于0.05 mol/L含5 mmol/L Ca2+、4 mmol/L Mg2+的Tris-HCl(pH 8.6)緩沖溶液。加入DNA酶 800 U，蛇毒磷酸二酯酶(Snake 酶)0.1 U，37 ℃避光孵育20 h。隨后將消化后的反應液進行固相萃取凈化富集。

固相萃?。悍Q取100 mg C18固相萃取吸附劑，甲醇活化并裝入固相萃取小柱，5 mL水替換甲醇，取1 mL反應液通過固相萃取小柱，4 mL水溶液淋洗，抽干小柱(不滴水即可)，4 mL 40%甲醇水緩慢洗脫小柱(靠重力流下)，收集洗脫液并濃縮：N2吹干，復溶于500 μL甲醇，經(jīng)0.45 μm PTFE針頭濾器過濾后待測。

(±)anti-BPDE與dG反應合成BPDE-脫氧鳥苷加合物(±)anti-BPDE-N2-dG：參照王海林課題組的方法[15]，稱取0.1 mg (±)anti-BPDE溶于100 μL四氫呋喃-三乙胺(19∶1，體積比)溶液中；稱取4.8 mg的2′脫氧鳥苷(dG)溶于1.2 mL 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖溶液中，將兩者混勻，避光，室溫反應48 h。

固相萃?。悍Q取100 mg C18固相萃取吸附劑，甲醇活化并裝入固相萃取小柱，5 mL水替換甲醇，將反應液通過固相萃取小柱，再分別用2 mL的超純水、1 mL 10%甲醇水溶液、1 mL 30%甲醇水溶液淋洗，抽干小柱(不滴水即可)后，用2 mL甲醇洗脫小柱(靠重力流下)，收集洗脫液并濃縮(室溫揮發(fā))至1 mL后待測。

1.2.2 高效液相色譜純化合成的產(chǎn)物經(jīng)固相萃取后不能去除副產(chǎn)物四醇-BaP的干擾，因此，需繼續(xù)濃縮后經(jīng)高效液相色譜儀(DAD檢測器)進一步純化。選用PFP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%甲酸水(22.5∶77.5，體積比)，流速1.2 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，紫外檢測波長345 nm。反復多次進樣，并分別收集保留時間為22.887、28.090、30.430 、33.763 min的四種異構(gòu)體流出物，經(jīng)冷凍干燥后，分別復溶于500 μL的33%甲醇水溶液中，由圓二色譜儀對四種組分進行定性分析，確定四種立體異構(gòu)體出峰順序。將定性后的四種立體異構(gòu)體分別用紫外光譜定量，測定345 nm處紫外吸光度，根據(jù)ε345 nm=3.43×104L/(mol·cm)算出各物質(zhì)濃度[18]。

1.3 HPLC-MS/MS檢測anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體

色譜條件：PFPP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%甲酸水(28∶72)，流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：以正離子多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測，碰撞電壓：12 eV，母離子質(zhì)荷比(m/z)為570.15，子離子m/z為454.10；采用電噴霧離子源(ESI+)；霧化氣：3 L/min，離子源加熱氣:10 L/min，干燥氣:10 L/min，離子源溫度：250 ℃，脫溶劑管溫度：150 ℃；加熱塊溫度：350 ℃；碰撞誘導解離氣：270 kPa；采集時間(Dwell time)：100 ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體的制備

2.1.1 anti-BPDE-N2-dG合成方法的選擇使用HPLC-MS/MS定量檢測苯并芘DNA加合物時，由于無市售的加合物標準品，需要合成相應的純品。根據(jù)文獻報道，苯并芘的脫氧鳥苷加合物主要有兩種合成方法，一種是BPDE與小牛胸腺DNA反應生成BPDE的脫氧鳥苷酸加合物(BPDE-dGMP)[21]，另一種為(±)anti-BPDE直接與2′脫氧鳥苷(dG)反應生成anti-BPDE-N2-dG[15]。本實驗對兩種方法進行了對比。第一種(具體步驟見“1.2.1”)中，BPDE與小牛胸腺DNA反應后，酶解至單核苷酸，經(jīng)固相萃取純化，質(zhì)譜子離子掃描[21]，驗證合成BPDE-dGMP。但此合成過程中(±)anti-BPDE的用量大，因為DNA中除鳥嘌呤外，還有其他堿基會與BPDE反應從而消耗BPDE；合成過程需酶解，耗時且酶價格較昂貴，而繁瑣的反應過程也使得實驗的重復性較差。第二種方法選擇(±)anti-BPDE與dG直接反應生成(±)anti-BPDE-N2-dG，經(jīng)固相萃取初步純化后，采用質(zhì)譜子離子掃描[15,17]驗證合成的anti-BPDE-N2-dG。該方法中(±)anti-BPDE的用量少，從經(jīng)濟和安全性角度均非常有益，且反應無需酶解，過程簡單方便，因此，本實驗選用該方法合成BPDE的DNA加合物標準品。

2.1.2 高效液相色譜純化目前，文獻報道的純化方法采用苯基柱需85 min[15]才能將anti-BPDE-N2-dG兩對對映體實現(xiàn)色譜分離提純，時間較長。本實驗采用常規(guī)的C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)對其進行分離，結(jié)果顯示在流動相條件為乙腈-水(18.5∶81.5，體積比)，流速0.75 mL/min，需要160 min才可實現(xiàn)六種物質(zhì)(BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體和兩種四醇-BaP)的分離，時間很長。因此，本實驗嘗試將不同于C18柱和苯基柱作用機制的五氟苯基柱(PFP柱)應用于兩對對映體的分離，并與常規(guī)C18色譜柱進行對比，結(jié)果如圖2所示。圖中星形標記的為anti-BPDE-N2-dG立體異構(gòu)體，峰1和峰2為副產(chǎn)物四醇-BaP的異構(gòu)體。結(jié)果表明：在相同流動相條件下(乙腈-水，體積比為26∶74，流速1.2 mL/min)，345 nm處紫外光譜檢測，anti-BPDE-N2-dG的四種立體異構(gòu)體在C18柱上只能看到兩個峰(圖2A)，而在相同規(guī)格的PFP色譜柱上(圖2B)可觀察到四種立體異構(gòu)體的分離。

與中性或堿性流動相相比，酸性流動相可增強cis-(+)-anti-BPDE-N2-dG的穩(wěn)定性，并提高四種立體異構(gòu)體的分離度[19]。因此，在水中加入0.1%甲酸作為流動相，PFP色譜柱在相同流動相比例下(乙腈-0.1%甲酸水，體積比26∶74，流速1.2 mL/min)，可觀察到anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體中的第2、3、4峰的分離度明顯增大，且第3與第4個峰已達到基線分離(圖2D)。在此酸性流動相條件下，anti-BPDE-N2-dG的四種立體異構(gòu)體在C18柱上可分離出三個峰(圖2C)，較中性流動相的兩個峰(圖2A)有明顯改善，但分離效果不及PFP色譜柱(圖2D)。

圖3 PFP色譜柱上分離anti-BPDE-N2-dG四種立體 異構(gòu)體及兩種四醇-B[a]P的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of four anti-BPDE-N2-dG stereoisomers and two BPDE tetrols obtained on PFP column the peaks of 1 and 2 are two BPDE tetrols，and the peaks labeled with asterisk are anti-BPDE-N2-dG stereoisomers；mobile phase： acetonitrile-0.1% formic acid(22.5∶77.5)；λ=345 nm

為了進一步增加四種立體異構(gòu)體在PFP色譜柱上的分離度，繼續(xù)調(diào)整流動相的比例，發(fā)現(xiàn)隨著有機相比例的減少，四種立體異構(gòu)體的分離度增加，六種物質(zhì)(anti-BPDE-N2-dG順反兩對異構(gòu)體和兩種四醇-B[a]P)的保留時間均向后移，但anti-BPDE-N2-dG后移速度快于四醇-B[a]P。因此，anti-BPDE-N2-dG與四醇-B[a]P的峰出現(xiàn)重疊，流動相比例為乙腈-0.1%甲酸水(22.5∶77.5)，流速1.2 mL/min時，45 min內(nèi)可將六種物質(zhì)完全分離開，分離度均大于2(如圖3)。分別收集anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體，即保留時間分別為22.887、28.090、30.430、33.763 min的流出物并冷凍干燥去除溶劑，復溶于33%甲醇水溶液中進行圓二色譜(CD)及紫外吸收光譜分析。

2.1.3 anti-BPDE-N2-dG合成條件的優(yōu)化為了提高anti-BPDE-N2-dG的合成產(chǎn)量，本實驗對(±)anti-BPDE直接與dG反應的溫度和時間進行了考察?？刂破渌磻獥l件不變，將相同的兩份樣品分別置于室溫(23.6 ℃)與37 ℃，避光反應24 h；固相萃取初步純化后，HPLC-DAD檢測(乙腈-水，26∶74，C18柱)anti-BPDE-N2-dG與四醇-B[a]P的含量(如圖2A)，并比較其峰高。結(jié)果如表1所示：表中anti-BPDE-N2-dG為圖2A中保留時間為11 min的峰，四醇-B[a]P 1為圖中保留時間為15 min的峰1，四醇-B[a]P 2為圖中保留時間為25 min的峰2。經(jīng)兩獨立樣本t檢驗顯示，室溫下anti-BPDE-N2-dG的產(chǎn)量較37 ℃高(P<0.05)(表1)，而四醇-B[a]P的量下降，表明室溫下更有利于主反應的進行?？刂破渌磻獥l件不變，僅將樣品在室溫反應時間由24 h延長至48 h，結(jié)果顯示：(±)anti-BPDE與dG反應48 h時，anti-BPDE-N2-dG與四醇-BaP的峰高較24 h均提高2倍多(見表1)。為了提高anti-BPDE-N2-dG的合成產(chǎn)量，本實驗將反應條件定為室溫反應48 h。

Experimental conditionAanti-BPDE-N2-dG(mAU)ABPDE tetrol 1(mAU)ABPDE tetrol 2(mAU)37 ℃,24 h52.17±0.28 74.17±0.73 2.56±0.37 23.6 ℃,24 h56.42±0.68 71.02±0.48 1.37±0.35 23.6 ℃,48 h 142.2±3.01 195.0±0.99 3.35±0.18

2.2 anti-BPDE-N2-dG立體異構(gòu)體的表征及定量

在HPLC-DAD上，anti-BPDE-N2-dG與副產(chǎn)物四醇-B[a]P的紫外吸收光譜很相似，但仍可通過比較紫外圖譜中280～282 nm和344～347 nm處相對吸收強度來區(qū)分anti-BPDE-N2-dG與四醇-B[a]P[15]。如圖4所示，anti-BPDE-N2-dG的紫外吸收在280～282 nm處相對較高，而兩種四醇-B[a]P的紫外吸收在344 nm處相對較高。此外，根據(jù)最長波長的紫外吸收峰位置還可粗略區(qū)分順反異構(gòu)體，cis(+)和cis(-)對映異構(gòu)體最長的紫外吸收峰位于347 nm，而trans(+)和trans(-)對映異構(gòu)體最長的紫外吸收峰位于346 nm處，cis-anti-BPDE-N2-dG相比于trans-anti-BPDE-N2-dG略有紅移[15,19]。

為了準確區(qū)分四種立體異構(gòu)體，以及其中的對映異構(gòu)體，將收集的四種組分復溶于33%甲醇水溶液中進行圓二色譜(CD)表征。對映異構(gòu)體加合物trans-(+)和trans-(-)，cis-(+)和cis-(-)的CD光譜相似，但符號相反。trans-(+)-和cis-(-)-anti-BPDE-N2-dG均具有10S的絕對構(gòu)型，且對其最強的CD波段(250 nm)均表現(xiàn)出正信號。而trans-(-)-和cis-(+)-anti-BPDE-N2-dG均具有10R的絕對構(gòu)型，且在相同的CD波段(250 nm)表現(xiàn)出負信號(圖5)。研究結(jié)果與文獻一致[19,22]。因此，確定PFP色譜柱分離anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體的出峰順序為trans(-)(22.887 min)、trans(+)(28.090 min)、cis(+)(30.430 min)、cis(-)(33.763 min)-anti-BPDE-N2-dG(圖3)。將復溶于33%甲醇水溶液的各異構(gòu)體溶液，測定其在345 nm處的紫外吸光度，可根據(jù)ε345 nm=3.43×104L/(mol·cm)算出各物質(zhì)的濃度[18]。

圖6 HPLC-MS/MS檢測anti-BPDE-N2-dG 四種立體異構(gòu)體的色譜圖Fig.6 Chromatogram for separation of four anti-BPDE-N2-dG stereoisomers recorded by HPLC-MS/MS

2.3 HPLC-MS/MS色譜分離條件的選擇

利用HPLC-MS/MS對樣品進行檢測時，質(zhì)譜在離子選擇模式下檢測可排除四醇-B[a]P的干擾，因此可不考慮四醇-B[a]P對色譜分離的影響，將anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體分開即可滿足檢測條件。如果將HPLC-DAD分離anti-BPDE-N2-dG的條件：乙腈-0.1%甲酸水(22.5∶77.5)，1.2 mL/min，PFP柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)直接應用于HPLC-MS/MS，1.2 mL/min流速的對于質(zhì)譜過高，不利于霧化，靈敏度偏低，故將流速設為0.5mL/min，調(diào)整流動相比例為乙腈-0.1%甲酸水(28∶72)，柱溫30 ℃，即可在30 min內(nèi)分離四種立體異構(gòu)體(圖6)，最小分離度可達0.995。與相同規(guī)格的苯基柱需要60 min才能將anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體分離相比，大大縮短了分離時間，提高了分離效率，節(jié)約了分離成本。

3 結(jié) 論

本文對現(xiàn)有的合成純化anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體(包含兩對對映異構(gòu)體)方法進行了改進。通過優(yōu)化反應溫度和時間，提高了反應產(chǎn)量，為定量檢測生物體苯并芘DNA加合物提供了標準品；并首次將五氟苯基色譜柱應用于anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體的色譜分離，利用HPLC可以實現(xiàn)45 min內(nèi)分離提純四種立體異構(gòu)體，建立了一種快速純化與分離anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體的方法。利用HPLC-MS/MS檢測四種anti-BPDE-N2-dG立體異構(gòu)體標準品時，使用常規(guī)的五氟苯基色譜柱可在30 min內(nèi)完成分離，大大提高了檢測效率。制備純化以及檢測分離anti-BPDE-N2-dG均可在同一色譜柱上完成，節(jié)約了分離成本。