皮瀟文,董 彪,吳曉江,汪紫薇,歐陽智林,彭冬英,付桂明,萬 茵,*

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330047;2.江西陽光乳業(yè)集團(tuán)有限公司,江西南昌 330200)

花生被譽(yù)為“植物肉”、“素中之葷”、“綠色牛乳”,具有止血、增強(qiáng)記憶、抗老化、降低膽固醇、抗癌等多種作用,深受人們喜愛,被廣泛用于食品行業(yè)。但花生是八大主要食物過敏原之一,可造成致敏性休克、死亡等嚴(yán)重過敏癥狀[1]。據(jù)調(diào)查,花生過敏患者占世界人口的1%～2%[2],花生過敏反應(yīng)造成的死亡占整個食物過敏死亡人數(shù)的59%[3]。

據(jù)報道,食品加工可影響食品的消化率、溶解度、致敏性等指標(biāo)[4-5],而微生物發(fā)酵作為改善和保持食物質(zhì)量的手段已經(jīng)使用了幾個世紀(jì),如可以改善食品的感官、物理和化學(xué)性質(zhì)[6],提高食物的營養(yǎng)價值及降低食物致敏性,具有成本低、無化學(xué)殘留物、使用安全、易于吸收、營養(yǎng)價值高等特點(diǎn)[7]。目前,利用微生物發(fā)酵降低花生致敏性的研究鮮有報道,但其已成功地降低牛奶[8-9]、大豆[10]和小麥[11]的過敏性。近年來僅有個別研究人員發(fā)現(xiàn)花生蛋白粉經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后,其過敏性和過敏原(Ara h 1和Ara h 2)含量降低,但未對發(fā)酵花生蛋白在消化過程中分子量和過敏性等變化進(jìn)一步研究[12]。

納豆芽孢桿菌是一種使用安全、耐酸、耐熱的微生物[12],具有抗菌[13]、抗癌、溶血栓[14]等多種功能,作為具有潛在增強(qiáng)腸道內(nèi)源性屏障機(jī)制和減輕腸道炎癥的益生菌,對花生過敏的治療以及感官、貨架期和營養(yǎng)品質(zhì)的發(fā)展具有重要作用[15-16]。因此,本文以花生漿(RPP)為研究對象,依次采用高壓蒸汽(121 ℃,20 min)滅菌、納豆芽孢桿菌發(fā)酵12～60 h處理后,對其凍干產(chǎn)物進(jìn)行理化指標(biāo)(水解度、多肽含量、可溶性蛋白含量)檢測,且采用體外模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)對處理前后的花生蛋白進(jìn)行蛋白分子量和致敏性分析,以期為低致敏性、高營養(yǎng)價值的花生制品的研發(fā)和花生過敏癥的脫敏治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生過敏患者血清(血清效價情況如表1,使用前需將所有患者血清混合) Plasmalab公司;花生 南昌旺中旺超市;納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto,BNCC 185325) 北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司;胃蛋白酶(3200 NFU/g)、胰蛋白酶(250 NFU/g)、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、四甲基乙二胺、5×蛋白上樣緩沖液 均為國產(chǎn)生化試劑,購于索萊寶科技有限公司;β-巰基乙醇、丙酮、鹽酸、過硫酸銨、氫氧化鈉、甲醇、冰乙酸 均為國產(chǎn)分析純,購于西隴科學(xué)股份有限公司。

表1 花生過敏患者血清信息

SJ-V80A全營養(yǎng)蔬果調(diào)理機(jī) 萊特電器有限公司;Labconco真空冷凍干燥機(jī) Thermo Fisher;HH-6電熱恒溫磁力攪拌水浴鍋 嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司;HWS-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海新苗實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械有限公司;Epoch-BioTek微孔板熒光讀數(shù)儀、Bio-Rad-Hercules-CA電泳儀 美國伯騰儀器有限公司;JM-L系列立式膠體磨 福建巨龍電機(jī)集團(tuán)有限公司;FA2004分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 花生經(jīng)清洗、浸泡、去紅衣后,按1∶9(花生質(zhì)量∶水的體積,w/v)進(jìn)行打漿,過膠體磨,即得花生漿(RPP);RPP經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后,即得經(jīng)高壓蒸汽處理的花生漿(APP);APP冷卻至室溫后,在無菌條件下接種納豆芽孢桿菌(9.8×105cfu/mL花生漿),在37 ℃,150 r/min條件下發(fā)酵12、24、36、48、60 h后取樣,得FAPP-B-12、FAPP-B-24、FAPP-B-36、FAPP-B-48、FAPP-B-60。所有樣品均經(jīng)預(yù)冷凍后,在-80 ℃、9 Pa條件下凍干成粉,-20 ℃保存分析。

1.2.2 水解度(DH)測定 參照周陽[12]的方法,對1.2.1各樣品的水解度進(jìn)行測定。

1.2.3 多肽含量測定 按劉聃等[17]的方法,對1.2.1各樣品的多肽含量進(jìn)行測定。

1.2.4 可溶性蛋白含量測定 蛋白提取:對Luo等[18]的方法進(jìn)行一定的修改。取一定質(zhì)量的1.2.1各樣品,用含有0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液以17∶1 (v/w)比例加入到樣品中,在4 ℃,200 r/min條件下攪拌2 h后,在4 ℃,6000 r/min條件下離心20 min,去除上清液,得到沉淀即脫脂蛋白,重復(fù)三次脫脂處理后,風(fēng)干,-20 ℃儲存待用。取上述脫脂花生蛋白按1∶10(w/v)加入Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH8.0)中,在4 ℃條件下攪拌4 h后,于4 ℃,8000 r/min的條件下離心40 min,收集上清液,并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

可溶性蛋白含量測定:用BCA試劑盒對上述提取的蛋白溶液進(jìn)行蛋白含量測定。

1.2.5 體外模擬消化實(shí)驗(yàn) 對何偉逸等[19]的方法進(jìn)行一定修改后,進(jìn)行體外模擬消化實(shí)驗(yàn)。

人造胃液:取0.320 g胃蛋白酶,用NaCl溶液(0.03 mol/L,pH1.2)溶解并定容至100 mL;人造腸液:取1 g胰蛋白酶,用KH2PO4緩沖液(0.05 mol/L,pH7.5)溶解并定容至100 mL。

1.2.5.1 體外模擬胃消化 取相同濃度各處理組蛋白提取液1 mL,加入250 μL人造胃液,調(diào)節(jié)pH至1.2,于37 ℃消化,分別于0、30、60、120 min取樣,將取樣的樣品pH調(diào)節(jié)至8,-20 ℃保存,直至分析。

1.2.5.2 體外模擬腸消化 取相同濃度蛋白提取液1 mL,加入250 μL腸液,調(diào)節(jié)pH至7.5,37 ℃消化,分別于0、30、60、120 min取樣,將取樣的樣品pH調(diào)節(jié)至3,-20 ℃保存,直至分析。

1.2.5.3 體外模擬胃腸連續(xù)消化 蛋白提取液經(jīng)胃液消化120 min后,調(diào)節(jié)pH至8,加入250 μL腸液,37 ℃消化,于15、30、60、120 min取樣,煮沸3 min終止反應(yīng),-20 ℃保存,直至分析。

1.2.6 SDS-PAGE實(shí)驗(yàn) 采用分離膠12%,濃縮膠5%對樣品蛋白進(jìn)行電泳操作。取消化樣品與上樣緩沖液按1∶3 (v/v)混合,煮沸3 min,12000 r/min離心4 min,用電壓80 V跑濃縮膠,電壓100 V跑分離膠,電泳完后,染色,脫色,拍照。

1.2.7 致敏性檢測方法—ELISA的建立 按照孫志闊等[20]的方法,建立花生過敏蛋白血清抗體ELISA檢測方法。分別用碳酸鹽緩沖溶液(0.015 mol/L Na2CO3,0.035 mol/L NaHCO3,pH9.6)將RPP蛋白提取溶液稀釋,在96孔酶標(biāo)板A～H行各孔分別加入已稀釋的不同濃度的花生蛋白溶液100 μL,4 ℃孵育12 h。倒掉包被液,用PBST洗滌3次后拍干(下同),每孔用含有脫脂牛奶50 mL/L的PBS溶液堵塞,37 ℃下水浴1 h;洗滌拍干,接著酶標(biāo)板1～12列加入100 μL不同稀釋度的血清(其中12列最后4孔留作對照,E12孔加入未稀釋血清做陽性對照,F12不加任何血清留作空白對照,G12和H12孔加入PBS溶液作陰性對照),37 ℃水浴后,洗滌拍干,每孔加入100 μL辣根過氧化物酶(HPR)標(biāo)記的兔抗人免疫球蛋白E(IgE)二抗(PBS稀釋,稀釋比例1∶20000),37 ℃水浴后;經(jīng)洗滌拍干后,每孔加入100 μL 3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液,37 ℃顯色15 min后,加入2 mol/L 硫酸50 μL終止反應(yīng),然后用酶標(biāo)儀檢測其在450 nm下的OD值。

以陰性孔OD值為標(biāo)準(zhǔn),若待測孔OD值約為1左右且其與陰性孔相應(yīng)稀釋度OD值的比值大于2.1時,即最佳抗原包被濃度和血清最佳稀釋度。

1.2.8 致敏性評價實(shí)驗(yàn) 以最佳抗原包被濃度和血清最佳稀釋度為前提,按照1.2.7對花生蛋白提取物進(jìn)行致敏性評價。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)三次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,SPSS 16.0分析其顯著性差異(P<0.05)。數(shù)據(jù)的曲線擬合采用OriginPro 2017(OriginLab Corp,USA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度測定結(jié)果

由圖1可知,與RPP相比,APP的蛋白水解度增加了1.0%,可能原因是RPP在高壓蒸汽處理?xiàng)l件下,其大分子花生蛋白受熱裂解成小分子多肽或氨基酸;APP經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后,其水解度隨著發(fā)酵時間的延長而增加,最高達(dá)到7.50%,其增加率為106.9%，可能原因是納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量蛋白酶,導(dǎo)致花生蛋白降解成多肽等小分子物質(zhì),從而提高了水解度,類似研究表明,微生物在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生蛋白酶水解大豆蛋白,且隨著發(fā)酵時間(0～48 h)的延長,大豆蛋白水解度逐漸增加[21]。

圖1 不同樣品水解度測定結(jié)果

2.2 多肽含量測定結(jié)果

由圖2可知,APP的多肽含量比RPP提高了21.5%,可能原因是花生蛋白在高壓蒸汽的條件下發(fā)生水解和裂解,將大分子蛋白降解為多肽;與APP相比,FAPP-B-12的多肽含量略有下降,但差異不顯著,可能原因是在發(fā)酵12 h之前,納豆芽孢桿菌需要大量繁殖,需消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)如肽,造成肽的消耗速度高于納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)肽速度;而發(fā)酵24～48 h時,多肽含量隨著發(fā)酵時間的延長而顯著增加,最高達(dá)到532.6 mg/g,可能原因是納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵過程中分泌大量蛋白酶,花生蛋白經(jīng)蛋白酶降解成多肽[22],且納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)肽速度遠(yuǎn)大于肽的消耗速度;而FAPP-B-60的多肽含量較于FAPP-B-48降低,可能原因是納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)肽速度低于肽的消耗速度或多肽進(jìn)一步降解成氨基酸等小分子物質(zhì)[22]。類似研究[22]也表明,豆粕經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后,其多肽含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。

圖2 不同樣品多肽含量測定結(jié)果

2.3 可溶性蛋白含量測定結(jié)果

由圖3可知,RPP經(jīng)高壓蒸汽處理后,其可溶性蛋白含量降低了37%,可能原因是RPP在高壓蒸汽處理過程中,其蛋白發(fā)生折疊,蛋白結(jié)構(gòu)變緊密,溶解性下降,或者其蛋白與花生中其他成分反應(yīng)形成難溶物,進(jìn)而導(dǎo)致可溶性蛋白含量下降。APP經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵12～36 h后,其可溶性蛋白含量隨著發(fā)酵時間的延長而上升,增長率最高可達(dá)42.8%，可能原因是納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵過程中分泌大量蛋白酶,將難溶性花生蛋白酶解轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白以及發(fā)酵菌體的菌體蛋白的增加[22];而APP經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵48～60 h后,其可溶性蛋白含量逐漸下降,原因可能是納豆芽孢桿菌對可溶性蛋白的消化水解作用。類似研究[22]表明,豆粕經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后,其可溶性蛋白在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

圖3 不同樣品可溶性蛋白含量測定結(jié)果

2.4 體外模擬消化前后花生蛋白分子量的變化

由圖4中胃消化(SD)0 min和腸消化(ID)0 min可看出,高壓蒸汽處理和納豆芽孢桿菌發(fā)酵均能降低蛋白分子量,且降低幅度較大,進(jìn)而可加快花生蛋白在體外模擬消化過程中的消化速度。由圖4 ID、SD和胃腸連續(xù)消化(DD)可見,花生蛋白條帶數(shù)量和色度隨著模擬胃液、腸液、胃腸液作用時間的延長而逐漸減少和變淺或消失,且隨著發(fā)酵時間的延長,蛋白條帶變淺和消失速度逐漸加快。由此可見,高壓蒸汽處理聯(lián)合納豆芽孢桿菌發(fā)酵降解花生蛋白的能力強(qiáng)于高壓蒸汽處理,可能原因是RPP經(jīng)高壓蒸汽處理后,其蛋白發(fā)生裂解,蛋白結(jié)構(gòu)被破壞,且進(jìn)一步經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后,其蛋白被納豆芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白酶降解[12-13],導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)破壞程度加大,進(jìn)一步促進(jìn)了胃腸液對花生蛋白的消化作用,且經(jīng)發(fā)酵處理的花生蛋白消化性隨著發(fā)酵時間的延長而增加。

圖4 花生蛋白在體外模擬消化階段的電泳圖

由圖4還可知,RPP蛋白在模擬SD和ID過程中,分子量大于35 kDa的蛋白條帶消失,分子量低于25 kDa的蛋白條帶逐漸變淺,但一直存在;而其經(jīng)DD 120 min后,蛋白條帶(>14.4 kDa)全部消失。由此可推斷花生蛋白經(jīng)胃腸液連續(xù)消化比單消化酶解效果更好,花生蛋白被降解更徹底。與本文研究結(jié)果相同,Cabanillasa等[23]發(fā)現(xiàn)高壓蒸汽處理(121 ℃,15 min或30 min)的油炸花生,其蛋白被胃蛋白酶消化后,分子量低于22 kDa的蛋白條帶隨著消化時間的延長而變淺,但一直存在;Yu等[24]用胰蛋白酶酶解生花生和油炸花生蛋白后,發(fā)現(xiàn)Ara h 1電泳條帶不可見,Ara h 2電泳條帶依然可見;Koppelman等[25]先用胃蛋白酶消化花生過敏原,發(fā)現(xiàn)Ara h 1、Ara h 3能迅速被消化,而Ara h 2和Ara h 6很難被胃蛋白酶分解,接著將Ara h 2和Ara h 6用胰蛋白酶消化,發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶確實(shí)能消化Ara h 2和Ara h 6。而Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 6的分子量分別為64、17、58、15 kDa[26]。

2.5 體外模擬消化前后花生蛋白致敏性的變化

由表2可得,當(dāng)花生蛋白溶液包被濃度為0.75 μg/mL,血清稀釋比例為1∶10時,待測孔OD值為1.091,其與陰性對照孔OD值(0.09)的比值為12.1,大于2.1,由此確定最佳花生蛋白溶液包被濃度為0.75 μg/mL,最佳血清稀釋比例為1∶10,檢測過敏性效果最佳。

表2 方正滴定法確定液態(tài)發(fā)酵花生蛋白致敏性檢測的的最佳抗原包被濃度和血清最佳稀釋度

由圖5可知,與SD 0 min和ID 0 min致敏性相比,高壓蒸汽處理和納豆芽孢桿菌發(fā)酵均降低花生的致敏性,可能是花生蛋白分子量降低所致。類似研究表明[23],油炸花生經(jīng)高壓蒸汽(138 ℃,30 min)處理后,其蛋白致敏性降低了96%,蛋白條帶(>29 kDa)消失,其降敏效果高于本研究中高壓蒸汽處理(121 ℃,20 min)的降低效果,原因是其高壓蒸汽的溫度與處理時間高于本研究。所有花生樣品蛋白經(jīng)胃、腸液及胃腸液連續(xù)消化后,其致敏性均降低,且隨著消化時間的延長,其致敏性呈下降趨勢,可能原因是花生蛋白被胃蛋白酶、胰蛋白酶降解,分子量降低,蛋白結(jié)構(gòu)改變,過敏表位被破壞或被掩藏[27],且花生樣品蛋白致敏性的降低趨勢與其分子量變化趨勢類似,這說明花生蛋白在胃腸消化過程中分子量的降低可能是其致敏性降低的原因;類似研究表明蛋白酶(堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味酶)水解作用降低了花生IgE結(jié)合能力[3,28-29]。

圖5 不同樣品蛋白在胃腸液消化過程中花生蛋白致敏性變化

由圖5可知,RPP、APP的蛋白經(jīng)胃液消化120 min后,其致敏性分別降低了32.5%和49.4%;而經(jīng)腸液消化120 min后,其致敏性分別降低了18.2%和21.6%。造成胃液降敏效果比腸液好的原因是胃蛋白酶能剪切多個位點(diǎn),具有廣泛特異性,而胰蛋白酶只能酶切Lys和Arg氨基酸鏈,具有局限性,導(dǎo)致它們對過敏位點(diǎn)破壞程度不同[3]。而且,花生蛋白經(jīng)胃液連續(xù)消化后的致敏性低于胃液或腸液單獨(dú)消化后的致敏性,說明模擬胃腸連續(xù)消化比單消化酶解效果更好,花生蛋白被降解更徹底,從而降低過敏原性[3],但是無論是胃腸單獨(dú)消化還是胃腸連續(xù)消化,都無法將花生致敏性完全去除,可能原因是蛋白質(zhì)消化后產(chǎn)生的肽仍然保留著部分IgE結(jié)合位點(diǎn)和特性[30]。

RPP經(jīng)高壓蒸汽處理后,蛋白質(zhì)發(fā)生水解反應(yīng)、疏水相互作用、二硫鍵的重組等反應(yīng),從而使蛋白結(jié)構(gòu)和分子量發(fā)生改變[31-32],導(dǎo)致APP蛋白易被消化液降解,破壞或掩藏花生過敏原表位;而APP經(jīng)納豆芽孢桿菌進(jìn)一步發(fā)酵后,APP蛋白結(jié)構(gòu)的破壞程度因納豆芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白酶的降解作用而加深,從而導(dǎo)致其蛋白更易被消化液降解,花生過敏表位破壞或掩藏程度加大。這導(dǎo)致了FAPP-B-60蛋白與其他蛋白相比,經(jīng)相同消化時間后,其致敏性最低。同時進(jìn)一步說明了高壓蒸汽處理聯(lián)合納豆芽孢桿菌發(fā)酵能降低RPP致敏性,且降敏效果強(qiáng)于高壓蒸汽處理。

3 結(jié)論

高壓蒸汽處理可降低花生蛋白分子量、致敏性、可溶性蛋白含量,提高花生蛋白水解度和多肽含量;而納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵處理后,可進(jìn)一步降低花生蛋白分子量、致敏性,增加花生蛋白水解度等指標(biāo)變化。結(jié)合理化指標(biāo)與致敏性等因素考慮,納豆芽孢桿菌發(fā)酵36 h的花生制品為最佳發(fā)酵產(chǎn)品,營養(yǎng)價值高,消化性好,致敏性低,有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。