于跑 彭倩倩 董晨 陳娜 張遠(yuǎn) 關(guān)鳳軍

1 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科（江蘇徐州221002）；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒腎科（江蘇徐州221002）

近年發(fā)現(xiàn)，激素依賴及頻繁復(fù)發(fā)腎病綜合征（steroid-dependent nephrotic syndrome/frequent relapse nephrotic syndrome，SDNS/FRNS）患兒有增加趨勢［1］。雖然臨床上在糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）的基礎(chǔ)上加用了環(huán)磷酰胺等免疫抑制劑治療，但仍存在相當(dāng)一部分復(fù)發(fā)病例。兒童原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）的發(fā)病機(jī)制迄今尚不明確。以往該病主要考慮與T 淋巴細(xì)胞功能紊亂有關(guān)［2］。而CD20 單克隆抗體（rituximab，RTX）治療這部分患兒有效提示了B 淋巴細(xì)胞可能參與了發(fā)病［3］。以往研究發(fā)現(xiàn)，PNS 外周血傳統(tǒng)B 淋巴細(xì)胞亞群分型顯示，CD19、CD20的表達(dá)在不同GC 反應(yīng)的患兒中無顯著性差異［4］。然而，B 淋巴細(xì)胞是由具有表型和功能的不同亞群組成的異質(zhì)性群體，不同B 淋巴細(xì)胞表型可能發(fā)揮著不同的作用。因此，探討B(tài) 淋巴細(xì)胞在PNS患兒免疫活化狀態(tài)中的作用，需進(jìn)行深入精細(xì)分型研究。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)測定SDNS/FRNS患兒B 淋巴細(xì)胞表型的分布情況，為評(píng)估SDNS/FRNS 患兒免疫功能狀態(tài)、疾病活動(dòng)預(yù)測提供重要的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年4月至2019年4月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院診斷為原發(fā)初治SDNS 患兒110例，門診隨訪1年，所有患兒均按照誘導(dǎo)緩解及鞏固治療2 個(gè)階段治療，按照患兒對(duì)GC 的療效及復(fù)發(fā)頻次，剔除13例未復(fù)發(fā)腎病綜合征患兒，其中50例SDNS/FRNS 患兒為研究組，男26例，女24例，年齡2.5～13（7.2 ± 3.8）歲；47例非頻繁復(fù)發(fā)腎病綜合征患兒為對(duì)照組，男25例，女22例，年齡2.5～14（7.3±3.8）歲。診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布的《兒童激素敏感、復(fù)發(fā)/依賴腎病綜合征診治指南（2016年）》的標(biāo)準(zhǔn)［5］。排除了感染、免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病及惡性腫瘤等繼發(fā)性因素。兩組的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有研究對(duì)象簽署知情同意書，本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 治療方法所有患兒初次發(fā)病時(shí)均給予醋酸潑尼松片（江蘇恒瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H41020636）2 mg/（kg·d），分3 次口服治療，正規(guī)減量。緩解期以臨床癥狀消失，蛋白尿轉(zhuǎn)陰為標(biāo)準(zhǔn)。所有病例均在蛋白尿轉(zhuǎn)陰后1 周內(nèi)復(fù)測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 主要試劑和儀器藻青蛋白（allophycocyanin，APC）標(biāo)記的抗人CD19 抗體、異硫氰熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的抗人CD27 單克隆抗體、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的抗人CD24 單克隆抗體、多甲藻葉綠素蛋白（peridinin chlorophyⅡprotein，Percp-cy5.5）抗人CD38 抗體、FITC 標(biāo)記的抗人CD3 單克隆抗體/PE 標(biāo)記的抗人CD（16+56）單克隆抗體，均購自Biolegend 公司。血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Sysmex xs-800i），LSRFortessaTM型流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences 公司），F(xiàn)ACSDvia 流式細(xì)胞分析軟件（美國BD Biosciences 公司）。

1.4 方法B 細(xì)胞及NK 細(xì)胞檢測：分別于初治前及緩解后抽取患兒清晨空腹1mL EDTA 抗凝靜脈血，其中0.5 mL 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測得總淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)；取100 μL EDTA 抗凝血，分別加入FITCCD3、APC-CD19 和PE-CD（16+56）抗體，室溫避光培養(yǎng)30 min 后，加2 mL 溶血素溶解紅細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2 次后，流式細(xì)胞術(shù)分析B 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，然后根據(jù)總淋巴細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算B 淋巴細(xì)胞及NK 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。B 細(xì)胞精細(xì)免疫分型檢測：取兩根流式管，分別標(biāo)記為B-1、B-2，B-1 為同型對(duì)照組，B-2 為待檢測組；B-1 管加入抗APC，F(xiàn)ITC、PE 和Percp-cy5.5 標(biāo)記的同型抗體；B-2 管加入抗CD19（APC）、抗CD27（FITC）、抗CD24（PE）和抗CD38（Percp-cy5.5）抗體；向B-1、B-2 管中各加入混勻的50 μL 待測樣品，混勻后室溫避光孵育30 min；用自配的紅細(xì)胞裂解液，37 ℃水溶約10 min，待完全溶血后，PBS 洗1 次后，流式細(xì)胞術(shù)分析得出各類B 細(xì)胞亞群的相對(duì)數(shù)（百分?jǐn)?shù)），該相對(duì)數(shù)為相對(duì)于B 細(xì)胞數(shù)目的百分?jǐn)?shù)；根據(jù)B 淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)和各B 細(xì)胞亞群的相對(duì)數(shù)（百分?jǐn)?shù)），計(jì)算獲得各B 細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)收集的組別資料分別進(jìn)行KS 檢驗(yàn)，以判斷所收集數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布及方差齊，若符合條件兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，同組治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，相關(guān)兩組數(shù)據(jù)間用Pearson 相關(guān)及Spearman 等級(jí)分析法分析數(shù)據(jù)間的相關(guān)性，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組B 淋巴細(xì)胞亞群及NK 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的表達(dá)情況比較活動(dòng)期：SDNS/FRNS 組患兒總CD19＋B 細(xì)胞、記憶B 細(xì)胞和過渡型B 細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；初始B 細(xì)胞及漿母細(xì)胞絕對(duì)數(shù)較對(duì)照組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；NK 細(xì)胞較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1～3。緩解期：兩組總CD19＋B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、過渡型B 細(xì)胞、初始B 細(xì)胞、漿細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)較對(duì)照組上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組總CD19＋B 細(xì)胞、記憶B 細(xì)胞和過渡型B 細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)較活動(dòng)期均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但SDNS/FRNS 組下降明顯；初始B 細(xì)胞、漿細(xì)胞絕對(duì)數(shù)較活動(dòng)期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組NK 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)較活動(dòng)期均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖1 SDNS/FRNS 患兒在GC 治療前B 淋巴細(xì)胞亞群百分比Fig.1 Percentage of B lymphocytes subsets in children with SDNS/FRNS before GC treatment

圖2 SDNS/FRNS 患兒在GC 治療后B 淋巴細(xì)胞亞群百分比Fig.2 Percentage of B lymphocytes subsets in children with SDNS/FRNS after GC treatment

2.2 SDNS/FRNS 組患兒NK 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)與CD19+B 淋巴細(xì)胞及其亞群的相關(guān)性分析SDNS/FRNS組患兒NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)與CD19+B 細(xì)胞（r=-0.554，P＜0.001）、過渡型B 細(xì)胞（r=-0.610，P＜0.001）、記憶B 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)（r=-0.617，P＜0.001）呈明顯負(fù)相關(guān)；與初始B 細(xì)胞（r= 0.022，P= 0.878）和漿母細(xì)胞（r=-0.151，P= 0.296）絕對(duì)數(shù)均未提示有相關(guān)性（圖4）。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)B 淋巴細(xì)胞功能紊亂在PNS的發(fā)病中起著非常重要的作用［6］。特別是應(yīng)用B 細(xì)胞耗竭劑（利妥昔單抗RTX）成功治療一些難治性NS 病例的報(bào)道［7］。RTX 以CD20 分子為靶點(diǎn)，能與細(xì)胞表面CD20 分子以高親和力結(jié)合，從而清除被結(jié)合的B 淋巴細(xì)胞，使體內(nèi)B 淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少。國外研究顯示,大多數(shù)自身抗體在耗盡后，其臨床反應(yīng)仍然存在［8］，這表明B 細(xì)胞可能以一種與抗體無關(guān)的方式導(dǎo)致組織損傷。外周血B 細(xì)胞按照發(fā)育階段及功能的不同，分為初始B、過渡型B、記憶B 及漿母4 群細(xì)胞，每群細(xì)胞具有不同的特征和功能，而CD20 表達(dá)于除祖B 細(xì)胞及漿母細(xì)胞外的前B 細(xì)胞至成熟B 細(xì)胞各階段的B細(xì)胞上［9］，因此表達(dá)CD20 分子的各個(gè)階段B 細(xì)胞理論上均為RTX 治療的靶細(xì)胞。然而國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用CD20 單抗治療SDNS/FRNS 患兒后，復(fù)發(fā)率僅有一定程度的減低，提示不同患兒可能存在各階段B 細(xì)胞表達(dá)的差異，從而臨床上呈現(xiàn)出不同的RTX療效，然而目前缺乏總體水平的監(jiān)測與分析［10］。

圖3 各組患兒CD19+總B 淋巴細(xì)胞及其亞群絕對(duì)數(shù)的統(tǒng)計(jì)Fig.3 Statistical map of the absolute number of subpopulations of CD19+total B lymphocytes in each group

圖4 NK 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)與CD19+B、過渡型B 及記憶B 淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation between absolute number of NK cells and absolute number of CD19+B，transitional B and memory B lymphocytes

本研究通過熒光標(biāo)記CD19、CD24、CD27 以及CD38 這4 種分子的不同組合，將過渡型B 細(xì)胞、初始B 細(xì)胞、記憶B 細(xì)胞以及漿母細(xì)胞4 個(gè)表型從B淋巴細(xì)胞中分選出來。既往研究發(fā)現(xiàn)，PNS 患兒外周血CD19+B 細(xì)胞數(shù)明顯高于正常兒童，同時(shí)在復(fù)發(fā)性NS 患兒中也發(fā)現(xiàn)，CD19+B 細(xì)胞數(shù)均顯著高于對(duì)照組，而在緩解的SDNS 患兒中B 細(xì)胞總量降低［11］。本研究顯示，兩組患兒發(fā)病初始CD19+B細(xì)胞絕對(duì)數(shù)升高，但SDNS/FRNS 組較對(duì)照組升高顯著，而經(jīng)過GC 治療緩解后降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示兩組患兒存在B 淋巴細(xì)胞異常活化與擴(kuò)增的亢進(jìn)，并且可能和患者疾病類型及活動(dòng)程度有一定關(guān)系。考慮可能與疾病活動(dòng)時(shí)B 淋巴細(xì)胞過度增殖、凋亡減少有關(guān)［12］。而KEMPER 等［13］在臨床觀察到未治療的SDNS 無論在復(fù)發(fā)活動(dòng)期或緩解期CD19+B 細(xì)胞數(shù)均降低，其原因可能由于免疫抑制治療的差異，免疫抑制治療可以直接或間接地影響B(tài) 淋巴細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和功能所致。

國外近期研究PNS 發(fā)作時(shí)總B 細(xì)胞水平的增加，過渡型和記憶B 細(xì)胞的水平明顯增加，在復(fù)發(fā)期間，總記憶B 細(xì)胞數(shù)顯著高于正常對(duì)照組，在緩解期，總記憶B 細(xì)胞數(shù)顯著減少［11］。另一項(xiàng)應(yīng)用利妥昔單抗治療FRNS 患者的研究［14］提出，記憶B細(xì)胞的恢復(fù)可以預(yù)測復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，提示記憶細(xì)胞的增高參與SDNS的發(fā)病。而本研究發(fā)現(xiàn)兩組過渡型B細(xì)胞、總記憶B細(xì)胞活動(dòng)期均上升，但SDNS/FRNS組升高更明顯，提示不同發(fā)育階段的B 淋巴細(xì)胞異常程度跟疾病活動(dòng)有關(guān)。過渡型B 細(xì)胞是B 細(xì)胞活化階段的關(guān)鍵時(shí)期，此階段細(xì)胞如果沒有受到抗原刺激轉(zhuǎn)換成記憶B 細(xì)胞則面臨凋亡，過度增加提示可能存在清除障礙或者功能障礙，因此，我們?cè)谘芯恐羞M(jìn)一步檢測了NK 細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過GC 治療后兩組NK 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)都有所下降，此結(jié)果與周暉登等［15］的研究結(jié)果一致。同時(shí)我們通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)SDNS/FRNS 組活動(dòng)期外周血NK 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)與CD19+B 細(xì)胞、過渡型B細(xì)胞、記憶B 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。由于NK 細(xì)胞是體內(nèi)非特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)多種細(xì)胞如T、B 淋巴細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用［16］，因此筆者推測在SDNS/FRNS 患兒中存在NK 細(xì)胞功能障礙，進(jìn)而影響了過渡型B、記憶B 淋巴細(xì)胞的清除。而NK 細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的減少，則減弱了對(duì)T、B 淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用，從而使B 淋巴細(xì)胞及其各亞群也出現(xiàn)功能紊亂及數(shù)量變化，從而產(chǎn)生臨床癥狀及體征以及實(shí)驗(yàn)室檢查的變化。

目前對(duì)過渡型B 細(xì)胞的活動(dòng)規(guī)律還不完全清楚，在兒童SDNS/FRNS 發(fā)病機(jī)制中的具體作用尚未完全闡明［17］。而記憶B 細(xì)胞作為最特殊的抗原特異性B 細(xì)胞，在生存、激活、增殖、免疫球蛋白分泌和抗原表達(dá)等方面的基因表達(dá)增加，使它們成為免疫應(yīng)答的高效激活者［18］，在SDNS/FRNS 發(fā)病時(shí)增多可能與抗原刺激其大量增殖有關(guān)，但如何被異常激活，有關(guān)清除以及功能障礙的研究值得未來進(jìn)一步探索。

綜上，B 淋巴細(xì)胞亞群在SDNS/FRNS 患兒體內(nèi)存在分布異常，其異常的程度可提示疾病類型，尤其過渡型B 細(xì)胞、記憶B 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)顯著增多往往提示患兒激素依賴或者頻繁復(fù)發(fā)；同時(shí)也為SDNS/FRNS 患兒新的治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。NK 細(xì)胞與SDNS/FRNS 患兒的過渡型B 細(xì)胞、記憶B 細(xì)胞的清除障礙密切相關(guān)。