劉景 孔紅嬌 胡繼君 魏雅靜 周夢鴿 王云霞 李娜

輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）最理想結(jié)局是獲得一個健康的子代。然而，傳統(tǒng)ART 通常通過增加胚胎移植數(shù)目來提高妊娠成功率，但同時伴隨的是多胎妊娠率的顯著增加。目前我國的多胎妊娠率已超過30%，有些生殖中心甚至高達40%以上［1］，是自然多胎妊娠的幾十倍。多胎妊娠是ART 治療后孕產(chǎn)婦最嚴重的并發(fā)癥之一。多胎妊娠所導(dǎo)致的妊娠期高血壓、早產(chǎn)和低出生體重兒等并發(fā)癥給患者的家庭和社會造成嚴重的負擔［2］。因此為了有效降低多胎妊娠率，不少學者建議行單囊胚移植［3-4］。目前，關(guān)于單囊胚移植的研究大部分還只關(guān)注臨床妊娠率，活產(chǎn)率作為主要觀察指標的研究較少。為探討既可以保證高妊娠率，又可以降低多胎妊娠率的最佳凍融囊胚移植方案，本研究對在鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖中心首次行D5/D6 凍融囊胚移植周期的相關(guān)數(shù)據(jù)進行了回顧性分析，觀察其妊娠結(jié)局，旨在為臨床治療提供數(shù)據(jù)指導(dǎo)。

1 資料和方法

1.1 一般資料本研究回顧性分析2016年1月至2018年7月在鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖中心首次進行D5/D6 囊胚凍融移植（freezing-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET）周期的（n= 2 582）患者病歷資料。納入標準：凍融囊胚移植；自體卵母細胞；子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm。排除標準：反復(fù)移植失敗患者；患有基礎(chǔ)疾??；胚胎植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）周期；凍卵與供卵周期；子宮肌瘤或子宮內(nèi)膜異位癥；其他內(nèi)分泌疾?。粌?nèi)膜病變；數(shù)據(jù)不全周期。

1.2 方法根據(jù)移植的囊胚數(shù)目及評分對女性患者年齡≤37歲組和＞37歲組分別分A、B、C、D、E 5 個亞組。分別為1 枚優(yōu)質(zhì)囊胚移植組（A 組）、1 枚非優(yōu)質(zhì)囊胚移植組（B 組）、2 枚優(yōu)質(zhì)囊胚移植組（C 組）、1 枚優(yōu)質(zhì)囊胚和1 枚非優(yōu)質(zhì)囊胚協(xié)同移植組（D 組）、2 枚非優(yōu)質(zhì)囊胚移植組（E 組），分別比較兩組中不同囊胚移植方案的妊娠結(jié)局。對主要觀察指標活產(chǎn)率及多胎妊娠率，次要觀察指標植入率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率進行組間比較。

1.2.1 胚胎冷凍和解凍采用玻璃化冷凍復(fù)蘇試劑盒（Kitazato，日本）。試劑從冰箱內(nèi)取出后于室溫下平衡至少30 min。將囊胚移入平衡液（equilibrium solution，ES），10 min 后轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液（vitrification solution，VS）中平衡，于60 s 內(nèi)將囊胚放至已標記的冷凍載體（Kitazato，日本）上，迅速投入液氮并裝入套管。解凍時，去除載體套管，將胚胎端迅速移至37 ℃解凍液（TS）中，使囊胚在TS 液中平衡1min，再將囊胚移入稀釋液（DS）和洗滌液1、2（WS1、WS2）中各3 min。最后將囊胚移入囊胚培養(yǎng)液（vitrolife，瑞典）中并置于37 ℃，含6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（平板培養(yǎng)箱，美國Cook 公司）等待移植。

1.2.2 囊胚評分及分組本中心采用Gardner 評分系統(tǒng)，根據(jù)囊腔擴張程度和是否孵化，將囊胚分為6 個時期。1 期：囊胚腔體積小于胚胎總體積的50%；2 期：囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的50%；3 期：囊胚腔完全占據(jù)胚胎的總體積；4 期：擴張囊胚，囊胚腔完全占滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄；5 期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6 期：完全孵出囊胚。將內(nèi)細胞團及滋養(yǎng)層細胞分為A-C 級。內(nèi)細胞團評分，A：細胞數(shù)目多，排列緊密；B：細胞數(shù)目少，排列松散；C：細胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層細胞評分，A：上皮細胞層有較多的細胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B：上皮細胞層有不多的細胞組成，結(jié)構(gòu)松散；C：上皮細胞層有稀疏的細胞組成。根據(jù)囊胚的發(fā)育階段以及內(nèi)細胞和滋養(yǎng)層細胞的形態(tài)對囊胚進行分級，優(yōu)質(zhì)囊胚定義為≥4BB（AA、AB、BA、BB）。因本中心僅冷凍內(nèi)細胞團評分為A 或B 的囊胚用于移植，所有非優(yōu)質(zhì)囊胚定義為＜4BB（AC、BC）。

1.2.3 臨床結(jié)局的判定及計算移植后14 d 抽血查驗HCG，陽性者于29 d 后行B 超檢查，測到孕囊者為臨床妊娠；將妊娠未達28 周、胎兒體重不足1 000 g 而終止妊娠者稱為流產(chǎn)；妊娠滿28 周并分娩的活產(chǎn)嬰兒稱為活產(chǎn)；一次妊娠宮腔內(nèi)同時有兩個或兩個以上胎兒時稱為多胎妊娠。著床率=孕囊數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期患者數(shù)× 100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率= 活產(chǎn)的分娩周期數(shù)/移植周期患者數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)（早期流產(chǎn)數(shù)+晚期流產(chǎn)數(shù)）/移植周期數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）；計數(shù)資料采用率表示，組間率的比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 年齡≤37 歲的5 組患者基本資料及妊娠結(jié)局比較

2.1.1 基本資料5 組共納入2 227 個周期，A 組590 個周期，B 組700 個周期，C 組206 個周期，D 組265 個周期，E 組466 個周期。5 組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、子宮內(nèi)膜厚度、FSH 和LH 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.1.2 年齡≤37 歲妊娠患者不同囊胚移植策略結(jié)局的比較與A 組相比，B 組和E 組植入率降低、C組增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；D組植入率增加（P＞0.05）。與A組比較，B組臨床妊娠率顯著降低（P＜0.05）；而C、D、E 組臨床妊娠率顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。E組流產(chǎn)率增加，B、C 和D 組降低，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與A 組比較，B 組活產(chǎn)率顯著降低（P＜0.05）；而C、D、E 組活產(chǎn)率顯著增加（P＜0.01）。B 組多胎妊娠率增加，但無顯著性差異（P＞0.05）；而C、D、E 組多胎妊娠率顯著增加（P＜0.01），見表2和圖1。

表1 年齡≤37 歲5 組患者的一般資料Tab.1 General information of 5 groups of patients in patients ≤37 years old ±s

表1 年齡≤37 歲5 組患者的一般資料Tab.1 General information of 5 groups of patients in patients ≤37 years old ±s

組別A 組B 組C 組D 組E 組F 值P 值年齡（歲）29.43±3.10 29.76±3.11 29.56±3.31 29.55±3.17 29.23±3.26 1.019 0.359 BMI（kg/m2）23.10±3.34 23.24±3.11 22.90±3.09 22.68±3.20 23.33±3.27 2.204 0.089內(nèi)膜厚度（mm）9.26±1.57 9.24±1.57 9.19±1.46 9.32±1.56 9.28±1.47 0.238 0.917 FSH（IU/L）6.25±1.95 6.43±2.25 6.14±2.00 6.20±1.92 6.21±1.82 1.456 0.102 LH（IU/L）5.45±3.57 5.25±3.87 6.02±5.15 5.30±4.16 5.12±3.06 2.069 0.082

表2 年齡≤37 歲患者不同囊胚移植策略妊娠結(jié)局的比較Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes in different blastocyst transfer strategies in patients ≤37 years old

2.2 年齡＞37 歲的5 組患者基本資料及妊娠結(jié)局比較

2.2.1 基本資料5 組共納入355 個周期，A 組84個周期，B 組163 個周期，C 組13 個周期，D 組31 個周期，E5 組64 個周期。5 組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、子宮內(nèi)膜厚度、FSH 和LH 比較組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3）。

2.2.2 年齡＞37 歲妊娠患者不同囊胚移植策略結(jié)局的比較與A 組相比，B 組和E 組植入率降低、C組和D 組增加，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與A 組比較，B 組臨床妊娠率降低、C 組和E 組增加，差異均無顯著性（P＞0.05）；D 組臨床妊娠率增加（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。D 組流產(chǎn)率增加，B 組、C 組和E 組降低，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與A 組比較，B 組活產(chǎn)率降低、D 組和E 組增加，差異均無顯著性（P＞0.05）；而C 組活產(chǎn)率增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。B組多胎妊娠率降低，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；D 組顯著增加（P＜0.05）；C 組和E 組顯著增加（P＜0.01）。見表4和圖2。

圖1 年齡≤37 歲妊娠患者不同囊胚移植策略結(jié)局的比較Fig.1 Comparison of pregnancy outcomes in different blastocyst transfer strategies in patients ≤37 years old

表3 年齡＞37 歲5 組患者的一般資料Tab.3 General information of 5 groups of patients in patients ＞37 years old ±s

表3 年齡＞37 歲5 組患者的一般資料Tab.3 General information of 5 groups of patients in patients ＞37 years old ±s

組別A 組B 組C 組D 組E 組F 值P 值年齡（歲）39.93±2.14 40.72±2.32 40.77±2.31 40.58±2.42 40.52±2.35 1.721 0.145 BMI（kg/m2）23.72±2.95 24.21±2.84 24.24±2.79 24.02±3.39 25.97±18.37 0.765 0.549內(nèi)膜厚度（mm）9.07±1.88 9.34±1.59 9.56±1.30 9.17±1.69 9.52±2.00 0.761 0.551 FSH（IU/L）6.63±1.61 7.10±1.61 6.89±1.32 6.68±1.51 6.66±1.48 1.775 0.133 LH（IU/L）4.29±2.41 4.19±2.53 3.51±1.96 3.84±1.35 4.70±2.58 1.111 0.351

表4 年齡＞37 歲患者不同囊胚移植策略妊娠結(jié)局的比較Tab.4 Comparison of pregnancy outcomes in different blastocyst transfer strategies in patients ＞37 years old

圖2 ＞37 歲患者不同囊胚移植策略妊娠結(jié)局的比較Fig.2 Comparison of pregnancy outcomes in different blastocyst transfer strategies in patients ＞37 years old

3 討論

許多生殖中心針對年輕患者，為有效降低多胎妊娠風險，更傾向于單囊胚移植［5-6］。近年來大量研究結(jié)果支持這一觀點，HARBOTTLES 等［7］研究結(jié)果表明，單囊胚移植能顯著降低多胎妊娠率，同時減少早產(chǎn)和低出生體質(zhì)量兒比例。因此單囊胚移植逐漸被認為是一種降低多胎妊娠率較為理想的移植策略。但是對于不同人群、不同囊胚質(zhì)量，凍融囊胚移植策略的選擇仍存在爭議。

美國生殖醫(yī)學會推薦，年齡＜35 歲的女性患者實施選擇性單囊胚移植；英國衛(wèi)生保健分會（NICE）建議＜39歲的患者前兩個周期有≥1枚優(yōu)質(zhì)胚胎的行單胚胎移植；MANCUSO 等［8］建議＜38 歲的患者行單囊胚移植。且大量研究［9］表明，單胚胎移植周期不僅減少了多胎妊娠的發(fā)生率及相關(guān)風險，且兩個周期的累計妊娠率及持續(xù)活產(chǎn)率可達到一個周期移植兩枚胚胎相同的效果。本中心的既往數(shù)據(jù)顯示37 歲是影響活產(chǎn)率的年齡拐點（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。張玉婷等［10］研究結(jié)果也支持這個觀點，38 ～40 歲及41 ～43 歲患者活產(chǎn)率與35 ～37 歲相比呈斷崖式下降，分別為21.5%，8.1%及32.5%?；町a(chǎn)率是本研究的主要觀察指標，因此，我們以37 歲為界限來分析不同組別的各個臨床治療結(jié)局。本研究結(jié)果顯示，年齡≤37 歲患者，單優(yōu)質(zhì)囊胚組雖然臨床妊娠率低于移植雙優(yōu)質(zhì)囊胚組，但仍可達到50%以上，而多胎妊娠率下降到2.0%；相反，移植雙優(yōu)質(zhì)囊胚組雖然臨床妊娠率和活產(chǎn)率分別可達到84.0%和75.7%，但多胎妊娠胎率達57.2%。此結(jié)果與先前發(fā)表文獻結(jié)果［11］一致。多胎妊娠可導(dǎo)致妊娠期高血壓等嚴重并發(fā)癥，考慮到母嬰風險增高。因此，當有優(yōu)質(zhì)囊胚可移植時，進行單囊胚移植將會是最佳的移植方案。

自二孩政策開放以來，高齡不孕患者逐漸增多，而生育力低下問題備受關(guān)注。隨著年齡增長，卵巢功能減退導(dǎo)致卵母細胞數(shù)目和質(zhì)量下降［12］，進而導(dǎo)致妊娠率降低。目前，高齡患者妊娠結(jié)局仍不理想，且面臨巨大的倫理挑戰(zhàn)［13］，對于高齡患者凍融周期囊胚移植策略仍在探索中。劉杰等［14］認為＞37 歲患者應(yīng)根據(jù)實際情況及胚胎質(zhì)量綜合決定移植策略；而呂興鈺等［15］認為＞38 歲患者可行雙囊胚移植。本研究結(jié)果顯示，年齡＞37 歲的患者，雖然雙優(yōu)質(zhì)囊胚移植后活產(chǎn)率增加，但同時，多胎妊娠率也顯著增加。因此，對于高齡患者，具有2 枚及以上優(yōu)質(zhì)囊胚可移植時，筆者建議單囊胚移植。僅有≤1 枚優(yōu)質(zhì)囊胚時，建議在詳盡告知雙胎妊娠存在的風險后，患者仍強烈要求移植兩枚囊胚的情況下，可以在成熟的減胎技術(shù)支持下進行雙囊胚的移植，并告知如雙胎妊娠建議減胎。

與優(yōu)質(zhì)囊胚相比，非優(yōu)質(zhì)囊胚的發(fā)育潛能降低，對其移植策略仍存在爭議。WINTNER 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，1 枚優(yōu)質(zhì)和1 枚非優(yōu)質(zhì)囊胚協(xié)同移植時非優(yōu)質(zhì)囊胚不會對優(yōu)質(zhì)囊胚的植入產(chǎn)生不利影響。而EL-DANASOURI 等［17］卻研究發(fā)現(xiàn)，非優(yōu)質(zhì)胚胎可能對優(yōu)質(zhì)胚胎的植入產(chǎn)生不利影響。非優(yōu)質(zhì)囊胚與優(yōu)質(zhì)囊胚協(xié)同移植后，前者對后者是否有不良影響仍存爭議。本研究結(jié)果表明，年齡≤37 歲患者，移植1 枚優(yōu)質(zhì)協(xié)同1 枚非優(yōu)質(zhì)雙囊胚的臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著高于移植單優(yōu)質(zhì)囊胚，提示非優(yōu)質(zhì)囊胚并未對優(yōu)質(zhì)囊胚產(chǎn)生不利影響。但由于多胎妊娠率明顯增高（2.0%vs.55.7%，P=0.000），筆者仍不建議進行雙囊胚移植。年齡＞37 歲的患者，移植1 枚優(yōu)質(zhì)協(xié)同1 枚非優(yōu)質(zhì)雙囊胚組的活產(chǎn)率未明顯高于單優(yōu)質(zhì)囊胚組，但多胎妊娠率增加（7.8%vs.38.1%，P= 0.011），建議單囊胚移植。本研究結(jié)果也顯示，無論年齡≤37 歲或＞37 歲患者，移植2 枚非優(yōu)質(zhì)囊胚組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率均高于移植單優(yōu)質(zhì)囊胚組，同時，多胎妊娠率也顯著增加，尤其對于年齡≤37 歲患者（2.0%vs.45.1%）。分析其原因，筆者認為本研究結(jié)果在一定程度上可能受到胚胎分級方法的影響，即胚胎的形態(tài)學評估存在主觀性。我們發(fā)現(xiàn)，無論≤37 歲或＞37 歲患者，與單囊胚移植周期相比，無論移植囊胚的質(zhì)量如何，雙囊胚移植都顯著增加了多胎妊娠率。一些研究［18］表明，雖然向患者解釋兩個周期的選擇性單囊胚移植可以獲得與雙囊胚移植一個周期相似的活產(chǎn)率，但對于一些女性（特別是高齡女性）患者而言，與雙囊胚移植妊娠率增加相比，多胎妊娠的風險是可以接受的。而VAN HEESCH 等［19］和SCOTLAND 等［20］研究表明多胎妊娠遠期情況不太理想。因此綜合考慮妊娠結(jié)局和多胎妊娠給母兒帶來的風險，當患者有優(yōu)質(zhì)囊胚時，仍建議單囊胚移植。

綜上所述，無論≤37 歲或＞37 歲患者，當患者有≥2 優(yōu)質(zhì)囊胚可用于移植時，我們建議單囊胚移植。僅有≤1 枚優(yōu)質(zhì)囊胚時，對于≤37 歲患者，不建議行雙囊胚移植；對于＞37 歲患者，建議單囊胚移植，或特殊情況下在成熟的減胎技術(shù)支持下進行雙囊胚的移植。