朱偉艷 劉田雨 劉永珠 張欣寧 姚書忠

【摘要】 目的：探討Slit2蛋白表達(dá)水平與早期宮頸鱗癌患者的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法：選擇2005年1月-2010年12月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療的早期宮頸鱗癌患者共115例，正常宮頸上皮20例及高級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變30例，采用免疫組化方法檢測(cè)組織中Slit2的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：Slit2蛋白在正常宮頸、高級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變宮頸組織及早期宮頸鱗癌組織中的陽性表達(dá)率呈逐漸下降趨勢(shì)（P<0.001）。在早期宮頸鱗癌組織中，Slit2蛋白的表達(dá)與FIGO分期、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴脈管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均顯著有關(guān)（P<0.05），而與年齡、組織分化程度無關(guān)（P>0.05）。Slit2陰性表達(dá)患者術(shù)后5年總生存率顯著低于陽性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：Slit2的表達(dá)可能參與了宮頸癌的發(fā)生，與腫瘤臨床病理特征和預(yù)后明顯相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 Slit2 宮頸鱗癌 免疫組化 臨床病理特征 5年總生存率

Expression and Significance of Slit2 Protein in Early Cervical Squamous Cell Carcinoma/ZHU Weiyan， LIU Tianyu， LIU Yongzhu， ZHANG Xinning， YAO Shuzhong. //Medical Innovation of China， 2020， 17（01）： -135

[Abstract] Objective： To investigate the relationship between the expression level of Slit2 protein and the clinicopathological features and prognosis of patients with early cervical squamous cell carcinoma. Method：From January 2005 to December 2010， 115 cases of early cervical squamous cell carcinoma， 20 cases of normal cervical epithelium and 30 cases of high-grade cervical squamous intraepithelial lesions were selected from the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University. The expression of Slit2 was detected by immunohistochemistry， the relationship between its expression and the prognosis of cervical cancer was analyzed. Result： Slit2 protein in normal cervix， expression of high-grade cervical squamous intraepithelial lesions and cervical cancer， cervix tissue was gradually decreased （P<0.001）. In early cervical squamous cell carcinoma， the expression of Slit2 protein was significantly correlated with FIGO stage， tumor size， depth of invasion， lymphatic vessel infiltration and lymph node metastasis （P<0.05）， but not related to age and tissue differentiation （P>0.05）. The 5-year overall survival rate of patients with negative expression of Slit2 was significantly lower than that of positive patients （P<0.05）. Conclusion： The expression of Slit2 may be involved in the occurrence of cervical cancer， which is significantly associated with the clinicopathological features and prognosis of the tumor.

[Key words] Slit2 Cervical squamous cell carcinoma Immunohistochemistry Clinicopathological features 5-year overall survival

First-authors address： The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University （Qingyuan Peoples Hospital）， Qingyuan 511518， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.01.034

宮頸癌是婦科最常見惡性腫瘤之一，目前是居于世界第三位的女性惡性腫瘤，已成為威脅女性健康和生命的嚴(yán)重疾病[1]。宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒感染相關(guān)[2-3]，但一些基因也參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[4]。Slit2是一種分泌性糖蛋白，在鼻咽癌、直腸癌、胃癌等消化道腫瘤及乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等生殖系腫瘤中均有表達(dá)[5]。研究表明Slit2在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，并參與腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[6-11]。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)Slit2在腫瘤中表達(dá)下降，發(fā)揮抑癌基因的作用[9]。基于此，該研究旨在分析Slit2蛋白表達(dá)水平與早期宮頸鱗癌患者的臨床病理特征及臨床預(yù)后的關(guān)系，以期為子宮頸癌的預(yù)防、治療及預(yù)后判斷提供新的靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2005年1月-2010年12月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療的早期宮頸鱗癌（ECSCC）患者共115例。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①局限于宮頸部位的宮頸癌，臨床分期在ⅡA2期以內(nèi);②術(shù)前病理檢查明確鱗狀細(xì)胞癌;③標(biāo)本切取前未接受放療、化療等治療;④心肺等重要臟器功能可以耐受手術(shù);⑤術(shù)后堅(jiān)持接受隨訪。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前曾接受放療、化療;②病理檢查提示非鱗狀細(xì)胞癌;③病歷資料不完全，或不能配合隨訪;④腫瘤臨床分期超過ⅡA2期;⑤心肺功能不全，或合并其他嚴(yán)重內(nèi)科疾病不能耐受手術(shù)。另選擇同期子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)獲得正常宮頸上皮（NCT）患者共20例，高級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）行宮頸錐切術(shù)患者共30例。所有患者在患者和家屬知情、自愿參與的情況下開展，病例納入和隨機(jī)分組方法均經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 手術(shù)切除三組宮頸組織，制作免疫組化石蠟切片，運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)Slit2蛋白的表達(dá)情況。主要步驟：常規(guī)制作組織切片，厚度5 μm，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，抗原修復(fù)，加入3% H2O2溶液27 ℃孵育20 min，滴加正常山羊血清工作液，27 ℃孵育30 min;滴加鼠抗兔TSG-6單克隆抗體一抗（江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1︰2000），置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，以正常小鼠IgG代替一抗作為陰性對(duì)照;滴加驢抗鼠IgG多克隆抗體二抗（江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1︰500），置于濕盒中27 ℃孵育20 min;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（江蘇碧云天科技有限公司），置于濕盒中27 ℃孵育20 min，PBS振蕩洗滌5 min×3次;DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、氨水返藍(lán)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、室溫晾干、光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 采用雙盲法，以細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，染色強(qiáng)度分4級(jí)：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比，即某類細(xì)胞5個(gè)視野（每400×高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)此類細(xì)胞）中陽性細(xì)胞所占比例的平均數(shù)，也可分為4級(jí)：0～5%，為0分;6%～25%，為1分;26%～50%，為2分;51%～75%，為3分;>75%，為4分。將上述兩項(xiàng)指標(biāo)（染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比）分?jǐn)?shù)相乘，按乘積結(jié)果評(píng)定免疫組化結(jié)果，即乘積0～2分為陰性，≥3分為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用字2檢驗(yàn)，均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組Slit2蛋白的表達(dá)情況比較 Slit2蛋白在NCT、HSIL及ECSCC組織中的陽性表達(dá)率呈逐漸下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。并且NCT、HSIL、ECSCC三組中兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.005）。見表1。

2.2 Slit2蛋白陽性表達(dá)與早期宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系 早期宮頸鱗癌組織中，Slit2蛋白的陽性表達(dá)與臨床FIGO分期（P=0.019）、腫瘤大小（P=0.033）、浸潤(rùn)深度（P=0.003）、淋巴脈管浸潤(rùn)（P=0.022）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.038）顯著相關(guān)，而與年齡、組織分化程度無關(guān)（P>0.05）。見表2。

2.3 Slit2蛋白表達(dá)與早期宮頸鱗癌臨床預(yù)后的關(guān)

系 根據(jù)免疫組化評(píng)分結(jié)果，將115例早期宮頸鱗癌分為Slit2高表達(dá)組和Slit2低表達(dá)組。其中Slit2高表達(dá)組32例，Slit2低表達(dá)組83例。運(yùn)用Kaplan-Meire生存分析，Slit2低表達(dá)組患者的術(shù)后生存率較Slit2高表達(dá)組降低，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

3 討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，其癌變過程的分子基礎(chǔ)包括抑癌基因的表達(dá)下降以及癌基因的異常過表達(dá)。DNA甲基化是抑癌基因失活的一個(gè)主要原因，它主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)的CpG島。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中普遍存在抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化的現(xiàn)象[12]。因此，研究抑癌基因甲基化有助于進(jìn)一步揭示宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。美國(guó)學(xué)者Narayan等運(yùn)用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）發(fā)現(xiàn)，在浸潤(rùn)性宮頸癌中Slit2在mRNA水平表達(dá)下降、其啟動(dòng)子甲基化水平升高，提示Slit2表達(dá)水平改變參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的過程[13]。

文獻(xiàn)[14]報(bào)道Slit2在血管形成過程中也發(fā)揮了重要作用，由于受體的不同，其在腫瘤血管生成中的作用也會(huì)發(fā)生改變，在腫瘤生長(zhǎng)的早期Slit2主要起抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，而在腫瘤血管形成期，Slit2則通過對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化作用和促進(jìn)血管生成的作用從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[15]。

Slit2無論是在腫瘤的凋亡、血管新生，還是侵襲轉(zhuǎn)移方面，均發(fā)揮了重要作用，并且前期其他學(xué)者的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在宮頸癌變過程中Slit2的表達(dá)發(fā)生改變[16]。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)SLIT2蛋白在正常宮頸上皮、高級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變及早期宮頸鱗癌組織中陽性表達(dá)率呈逐漸下降趨勢(shì)。同時(shí)Slit2蛋白的表達(dá)與宮頸癌臨床FIGO分期、腫瘤大小、宮頸肌層浸潤(rùn)深度、淋巴脈管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與年齡、組織分化程度無關(guān)。本研究與黃小莉等[17]報(bào)道Slit2蛋白與宮頸癌臨床分期、宮頸癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與年齡、組織分化無關(guān)基本相符，但本研究提示Slit2蛋白表達(dá)與腫物大小有關(guān)，與黃小莉等[17]報(bào)道不一致。而且Slit2陰性表達(dá)患者術(shù)后5年總生存率較Slit2陽性表達(dá)患者明顯降低，與國(guó)外報(bào)道結(jié)果相符[18-20]。此結(jié)果提示在早期宮頸癌中Slit2的表達(dá)下調(diào)可能增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞的增殖能力，可能促進(jìn)宮頸癌的惡性進(jìn)展，可作為預(yù)測(cè)宮頸癌預(yù)后的指標(biāo)之一，有可能成為早期宮頸癌新的診治標(biāo)志物或者治療靶點(diǎn)。對(duì)宮頸癌病理組織結(jié)果Slit2蛋白陰性者臨床應(yīng)高度重視，制定個(gè)體化綜合治療方案，嚴(yán)密隨訪，適當(dāng)增加隨訪次數(shù)，縮短隨訪間隔，以降低宮頸癌治療后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，Slit2的表達(dá)可能參與了宮頸癌的發(fā)生，與腫瘤臨床特征和預(yù)后明顯相關(guān);可作為預(yù)測(cè)宮頸癌生存預(yù)后的有效指標(biāo)之一，有可能成為早期宮頸癌新的治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2019-06-20） （本文編輯：周亞杰）