尚 靜，張愛(ài)冬，張圣美，劉曉慧，查丁石，吳雪霞*

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，上海 201403)

植物正常的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖需要適宜的環(huán)境條件。然而，在植物生命周期中，植物體不可避免地要應(yīng)對(duì)各種不穩(wěn)定的非生物環(huán)境條件，包括高溫、低溫、干旱、鹽脅迫、重金屬含量過(guò)高、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)少和光照不足等。這些因素可能發(fā)生在植物生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期，進(jìn)而限制其生長(zhǎng)發(fā)育，甚至使植物不能完成生活史。對(duì)于農(nóng)作物和園藝作物而言，這些因素更會(huì)影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重?fù)p失。

在自然界中，植物經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)期的適應(yīng)與進(jìn)化，形成了一系列機(jī)制以適應(yīng)和抵御各種逆境脅迫[1]。轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控下游基因表達(dá)，協(xié)調(diào)信號(hào)途徑間的相互作用中發(fā)揮了重要的作用[2]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，許多重要的植物轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行了深入研究。WRKY家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其調(diào)控范圍涵蓋植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)等多種生理活動(dòng)[2]。與生物脅迫相比，對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫下的功能研究起步較晚[3]，但近年來(lái)多個(gè)研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫下同樣扮演著重要的角色，因此越來(lái)越受到研究者們的關(guān)注[4]。本文主要對(duì)近年來(lái)植物在非生物脅迫下WRKY轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮的功能做一概述。

1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的一般特性

1.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與分類

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類與DNA結(jié)合，進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的蛋白。WRKY轉(zhuǎn)錄因子至少含有一段60個(gè)左右的高度保守的氨基酸序列[5]，其中靠近N末端有1個(gè)七肽WRKYGQK，具有高度保守性，故而得名。WRKYGQK作為WRKY轉(zhuǎn)錄因子的核心序列，Q更容易發(fā)生變異，W、K和Y是保守的[6]。在其C末端有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)(Zinc-Finger Motif)，其一般組成為Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC型的鋅指結(jié)構(gòu)[7]，主要介導(dǎo)了WRKY轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)DNA序列的特異性結(jié)合。N末端WRKY結(jié)構(gòu)域雖然不具有DNA結(jié)合活性，但可以促進(jìn)C末端WRKY結(jié)構(gòu)域與靶基因的特異性結(jié)合[8-9]。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)特征，可將WRKY家族分為3個(gè)亞家族：第Ⅰ亞家族含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，第Ⅱ亞家族含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，第Ⅲ亞家族含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)[10]。其中第Ⅱ亞家族又根據(jù)氨基酸核心序列不同，被細(xì)分為5個(gè)亞組。

亮氨酸拉鏈(Leucine Zipper,LZ)是某些WRKY轉(zhuǎn)錄因子常見(jiàn)的氨基酸結(jié)構(gòu)域之一。這類轉(zhuǎn)錄因子有一段特殊的α螺旋，在此類α螺旋中頻繁出現(xiàn)亮氨酸且出現(xiàn)在α螺旋同側(cè)，直線排列成一條疏水帶，2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子就靠各自疏水帶間的疏水相互作用結(jié)合到一起，形成同源或異源二聚體即為亮氨酸拉鏈[11]。亮氨酸拉鏈本身并不與DNA結(jié)合，而是通過(guò)其氨基端上一段堿性區(qū)來(lái)與序列結(jié)合，若含亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子未形成二聚體，堿性區(qū)對(duì)DNA的親和力將會(huì)明顯下降。因?yàn)榇祟愞D(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合是以其堿性區(qū)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)作為整體來(lái)發(fā)揮作用的，所以此類結(jié)構(gòu)又經(jīng)常稱為堿性亮氨酸拉鏈(Basic-Leucine Zipper)。

除此之外，大部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子還具有脯氨酸富集區(qū)、谷氨酸富集區(qū)、絲氨酸/蘇氨酸富集區(qū)、激酶結(jié)構(gòu)域和TIR-NBS-LRRs等結(jié)構(gòu)[12]，這些結(jié)構(gòu)的存在使得WRKY轉(zhuǎn)錄因子在控制基因表達(dá)時(shí)能扮演多重角色。

1.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的起源

WRKY轉(zhuǎn)錄因子主要存在于高等植物中。根據(jù)已公開(kāi)的WRKY基因序列，編碼2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域的部分基因序列是從原生真核生物藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)、盤基網(wǎng)柄菌和衣藻中拷貝而來(lái)[12]，這為WRKY轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化提供了依據(jù)。在以上3個(gè)亞家族中，第Ⅰ亞家族通常被認(rèn)為是WRKY轉(zhuǎn)錄因子的祖先。隨著WRKY保守結(jié)構(gòu)域的丟失，產(chǎn)生WRKY轉(zhuǎn)錄因子的第Ⅱ亞家族；因植物生存的需要，WRKY轉(zhuǎn)錄因子C端鋅指結(jié)構(gòu)在第Ⅱ亞家族的基礎(chǔ)上發(fā)生突變，形成了第Ⅲ亞家族[2]。

1.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的作用途徑

1.3.1 與目標(biāo)DNA結(jié)合 在所有研究過(guò)的可能受WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的基因的啟動(dòng)子中，都能發(fā)現(xiàn)(T)TGAC(C/T)序列，稱為W-box[13]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)特異性地與靶基因啟動(dòng)子W-box順式元件相結(jié)合，在級(jí)聯(lián)反應(yīng)中充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活劑或抑制劑[9]。水稻OsWRKY47能夠與啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件直接結(jié)合，以正向調(diào)控水稻抗旱[14]。

1.3.2 與蛋白質(zhì)互作 WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)與不同蛋白間的相互作用，來(lái)實(shí)現(xiàn)其在不同逆境脅迫中相應(yīng)的應(yīng)答功能。如：酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明擬南芥AtWRKY40和AtWRKY60蛋白，AtWRKY36和AtWRKY38蛋白之間互作[15]。VQ蛋白多次被報(bào)道作為WRKY蛋白的共同作用因子參與到基因表達(dá)調(diào)控中[16]。Hu等發(fā)現(xiàn)AtWRKY8與VQ9通過(guò)相互拮抗調(diào)控植物的耐鹽性，鹽脅迫使得AtWRKY8基因表達(dá)量上調(diào)，突變體則表現(xiàn)出對(duì)鹽敏感的表型，相反vq9突變體則表現(xiàn)出耐鹽性[17]。李琪等在對(duì)擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，WRKY72可能與自身及一些近源WRKY轉(zhuǎn)錄因子互作,以多聚體的形式發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制子的功能,并參與特定的非生物脅迫相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[18]。值得一提的是，WRKY轉(zhuǎn)錄因子還可以結(jié)合到自身啟動(dòng)子序列的W-box上，進(jìn)行自調(diào)節(jié)和交叉調(diào)節(jié)。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)研究顯示PcWRKY1能結(jié)合其自身以及PcWRKY3啟動(dòng)子的W-box[19]。

1.3.3 參與調(diào)控信號(hào)網(wǎng)絡(luò) 非生物脅迫會(huì)誘導(dǎo)WRKY轉(zhuǎn)錄因子并觸發(fā)信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)以改善植物的抗逆性[13]。研究表明，MAP激酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)會(huì)響應(yīng)外界環(huán)境信號(hào)，MAP激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)通過(guò)修飾一些WRKY蛋白來(lái)調(diào)節(jié)它們的功能。MAPK是近年來(lái)被廣泛研究的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，該系統(tǒng)由MAPK、MAPK激酶(MKK)和MAPKK激酶(MEKK)構(gòu)成(圖1)。外界信號(hào)經(jīng)過(guò)該系統(tǒng)可被逐步放大并傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)生化和生理反應(yīng)[20]。WRKY40可以直接抑制ABA響應(yīng)基因的表達(dá)，如WRKY40能夠與WRKY18、WRKY60相互作用影響植物的ABA水平和非生物脅迫[21]。閆慧茹[22]研究發(fā)現(xiàn)，GhWRKY17超表達(dá)植株在種子萌發(fā)期和萌發(fā)后的生長(zhǎng)對(duì)ABA敏感，但對(duì)ABA調(diào)控的氣孔關(guān)閉不敏感，導(dǎo)致較高的失水率從而對(duì)干旱敏感，表明GhWRKY17通過(guò)ABA信號(hào)途徑參與植物的干旱脅迫反應(yīng)。

圖1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的植物應(yīng)答反應(yīng)模式圖[20]

1.3.4 迅速多向調(diào)控 WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因是通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)的，不依賴于從頭合成的調(diào)控因子，因此具有快速、瞬時(shí)的特點(diǎn)[3]。有的WRKY轉(zhuǎn)錄因子只受一種脅迫因子的誘導(dǎo)，有的卻同時(shí)受多種脅迫因子誘導(dǎo)，如在水稻中WRKY57基因受干旱、高鹽和PEG誘導(dǎo)，將WRKY57在擬南芥中高表達(dá)可顯著提高其對(duì)上述3種逆境的耐受性[23]。同一種脅迫也可能誘導(dǎo)多種WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。如Insaf等在對(duì)南瓜WRKY基因的研究中發(fā)現(xiàn)，24個(gè)CmWRKY基因?qū)λ謼l件有反應(yīng)，其中3個(gè)基因會(huì)在缺水條件下上調(diào)[24]。一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)應(yīng)多種逆境，一種逆境也可能對(duì)應(yīng)多個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，如此形成一個(gè)網(wǎng)狀調(diào)控系統(tǒng)，體現(xiàn)出植物調(diào)控非生物脅迫相關(guān)基因過(guò)程的復(fù)雜性和多樣性。

2 非生物脅迫下WRKY基因的功能

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，要應(yīng)對(duì)不斷變化的外界環(huán)境。當(dāng)環(huán)境條件超出植物能承受的區(qū)間，就會(huì)發(fā)生逆境脅迫。在逆境條件下，植物的生理生化過(guò)程會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變。逆境脅迫可以分為生物脅迫和非生物脅迫兩大類，非生物因素對(duì)植物性狀的影響較生物因素更為顯著[25-26]。近年來(lái)有研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在溫度脅迫、水分脅迫、鹽脅迫等非生物逆境中起到了重要的調(diào)控作用。

2.1 溫度脅迫

溫度在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用,當(dāng)環(huán)境溫度超出了植物的適應(yīng)范圍,就會(huì)對(duì)植物形成脅迫,溫度脅迫分為高溫脅迫和低溫脅迫，都對(duì)植物的生長(zhǎng)不利[27]。溫度脅迫被認(rèn)為是一個(gè)重要的非生物脅迫，它會(huì)影響植物光合作用、氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞膜流動(dòng)性、細(xì)胞滲透壓、蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)等生理和代謝反應(yīng)等[28]。對(duì)植物而言，高溫和低溫都是限制其生長(zhǎng)發(fā)育的主要不利因素。大量相關(guān)研究工作揭示了WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與了植物響應(yīng)高溫脅迫和低溫脅迫[29-30]。

高溫脅迫會(huì)損傷細(xì)胞膜并打破植物體內(nèi)的活性氧平衡等，影響植物的結(jié)構(gòu)和功能[31]。同時(shí)高溫還會(huì)抑制類囊體的活動(dòng)，尤其是光系統(tǒng)Ⅱ的反應(yīng)中心[32]?？踪毁籟33]在對(duì)文心蘭高溫處理后12 h發(fā)現(xiàn)OnWRKY1表達(dá)量升高，說(shuō)明OnWRKY1是一個(gè)與抗熱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。Dang等[34]研究發(fā)現(xiàn),辣椒葉片的CaWRKY40基因受高溫誘導(dǎo)后表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)。申磊[35]在研究CabZIP63和CaWRKY40兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子時(shí)發(fā)現(xiàn)，前者可以結(jié)合后者基因的啟動(dòng)子，在對(duì)高溫高濕脅迫下的應(yīng)答過(guò)程中，這種結(jié)合會(huì)被加強(qiáng)。

低溫脅迫也會(huì)導(dǎo)致植物光合作用效率下降，植物在受到低溫脅迫后，首先傷害的是細(xì)胞膜系統(tǒng)，進(jìn)而對(duì)植物光合色素含量、葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)、光合能量代謝、PSⅡ活性以及一系列重要生理生化過(guò)程都產(chǎn)生影響，最終出現(xiàn)植株損害嚴(yán)重或者死亡[36-37]。袁玉輝等[38]在對(duì)芥菜型油菜轉(zhuǎn)錄因子BjWRKY33的研究中表明，冷害(4 ℃)會(huì)誘導(dǎo)葉片中BjWRKY33基因表達(dá)量升高。小金海棠中MxWRKY基因在低溫處理(2 ℃)下也會(huì)被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[39]。在低溫脅迫條件下，8個(gè)茶樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在處理72 h內(nèi)顯著上調(diào)后又顯著下降，總體呈上升趨勢(shì)[40]。在低溫條件下，VaWRKY33過(guò)量表達(dá)的葡萄愈傷組織顯示出比空載體愈傷組織更低的低溫放熱值，這表明VaWRKY33可以增強(qiáng)葡萄愈傷組織對(duì)冷的耐受性[41]。Zheng等[42]在辣椒中挑選了16個(gè)WRKY基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)WRKY基因在冷脅迫下上調(diào)，CaWRKY6和CaWRKY42在低溫脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)，且在處理后6和3 h分別達(dá)到峰值。

2.2 水分脅迫

水分脅迫對(duì)植物造成傷害主要是因?yàn)橥寥浪止?yīng)不足，從而使植物葉片相對(duì)含水量及水勢(shì)降低，且使氣孔開(kāi)度降低，從而影響呼吸作用、光合作用和正常生長(zhǎng)發(fā)育[25]。WRKY基因在植物中的過(guò)表達(dá)對(duì)抗旱性的影響已經(jīng)有了廣泛的研究[43]。He等[44]在擬南芥中過(guò)表達(dá)TaWRKY33發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植株受到干旱脅迫時(shí)，其葉片失水率較野生型擬南芥低。Liu等[45]研究發(fā)現(xiàn)，將PbrWRKY53在煙草和烏蘇里梨中的過(guò)表達(dá)，可以增強(qiáng)兩者對(duì)干旱脅迫的耐受性，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出比野生型植株更高的含水率、抗氧化酶活性和代謝物含量，更少的活性氧成分。

2.3 鹽脅迫

鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致滲透效應(yīng)和鹽的特異性效應(yīng)，從而對(duì)植物造成傷害[46]。張惠媛等[47]發(fā)現(xiàn)，TaWRKY33會(huì)受鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)入擬南芥和小麥后均能提高兩者的耐鹽性。石文艷[48]從大豆中克隆得到的GmWRKY12在擬南芥中過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)的擬南芥的根長(zhǎng)在NaCl處理下比對(duì)照的長(zhǎng)、葉面積也更大，表明GmWRKY12提高了擬南芥的耐鹽性。NaCl處理3個(gè)轉(zhuǎn)GbWRKY32基因煙草種子和本生煙草種子，前者種子萌發(fā)率、全苗長(zhǎng)、根系、干重、鮮重均明顯高于后者，證明GbWRKY32基因可以提高煙草對(duì)鹽脅迫的抵御能力[49]。

2.4 其他非生物脅迫

營(yíng)養(yǎng)元素是植物生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，既可以作為植物體組成成分，又可以調(diào)節(jié)植物生理功能，直接參與并且協(xié)調(diào)作物的新陳代謝以及各種生理循環(huán)，因此在很大程度上限制著作物的產(chǎn)量以及品質(zhì)[50]。磷是植物體內(nèi)核酸、磷脂和ATP的重要組成部分,參與植物體內(nèi)能量代謝、酶促反應(yīng)、糖分代謝、光合作用等生理生化反應(yīng)[51]。因此，植物對(duì)磷素的吸收能力成為其生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵制約因素。柱花草StWRKY45基因在受低磷脅迫誘導(dǎo)時(shí)表現(xiàn)出高表達(dá)，推測(cè)StWRKY45基因可能參與柱花草對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)[52]。曾銘等[53]用qRT-PCR試驗(yàn)證明杉木在低磷脅迫下，ClWRKY8、ClWRKY21、ClWRKY24、ClWRKY35的表達(dá)量上調(diào)，表明這4個(gè)基因可能參與調(diào)控杉木對(duì)鹽脅迫耐受力。

絲瓜在采后儲(chǔ)藏和鮮切后,由于細(xì)胞呼吸作用產(chǎn)生過(guò)多的自由基而導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，從而使其細(xì)胞膜產(chǎn)生破裂，酚類物質(zhì)、酶和氧氣三者發(fā)生接觸并導(dǎo)致組織褐變,影響其感官品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值。劉建汀等[54]研究絲瓜鮮切后WRKY基因表達(dá)量變化發(fā)現(xiàn)，0～6 h內(nèi)絲瓜的4個(gè)WRKY基因表達(dá)量變化趨勢(shì)均呈上調(diào)趨勢(shì)，6 h后表達(dá)下調(diào)，但趨勢(shì)總體上調(diào)。

3 問(wèn)題與展望

種種研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗逆性方面發(fā)揮著巨大的作用。在非生物脅迫下，植物WRKY類轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與目標(biāo)DNA結(jié)合，與相關(guān)蛋白互作，參與調(diào)控信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，形成了多樣且復(fù)雜的網(wǎng)狀調(diào)控系統(tǒng)。已報(bào)道的WRKY轉(zhuǎn)錄因子主要著眼于一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子功能的研究，或與另一個(gè)蛋白之間的互作關(guān)系，對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中串?dāng)_機(jī)制尚未有整體把握。此外，內(nèi)外部刺激信號(hào)如何逐步傳遞給WRKY蛋白，WRKY家族成員間互作如何影響植物各種生理生化反應(yīng)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子核心序列的變異是否影響目的基因功能的改變等還不完全清楚，因此還需要進(jìn)一步深入探究和完善。

隨著生物信息學(xué)、基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的神秘面紗被揭開(kāi)。模式植物和一些植物基因組測(cè)序的完成為研究WRKY基因的表達(dá)和功能提供了條件，基因工程技術(shù)為作物遺傳改良提供新的途徑，也提高了培育植株抗逆新品種的效率。