楊秀娟 曹志勇 黃 偉 陳 琛 鄧 斌 譚敬儀 趙紅波

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)大數(shù)據(jù)學(xué)院，云南昆明650201；4.昆明學(xué)院發(fā)展規(guī)劃處，云南昆明650214；5.云南省農(nóng)村科技服務(wù)中心，云南昆明650021）

水蛭素是水蛭唾液腺分泌物中的一種蛋白質(zhì)，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的天然凝血酶特效抑制劑，是活血化淤的通經(jīng)良藥[1]。菲牛蛭（Hirudinaria manillensis）是一種廣泛分布于我國的代表性吸血類醫(yī)學(xué)水蛭，其含有多種活性成分，如菲牛蛭素[2-3]、纖維蛋白溶解酶[4]、抗血小板聚集活性成分[5]、抑菌活性成分[6]、透明質(zhì)酸酶、抗凝劑[7]，而最主要的活性成分為水蛭素?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，水蛭素在心腦血管疾病、動脈粥樣硬化、敗血休克、高血壓以及缺少抗凝血酶Ⅲ因子等疾病方面具有巨大的優(yōu)越性和廣闊的應(yīng)用前景[8]。隨著對醫(yī)學(xué)水蛭研究的逐步深入，國內(nèi)外對水蛭類藥品的不斷開發(fā)，菲牛蛭需求量逐漸增大，而野生資源卻日益枯竭，致使供需矛盾尖銳。近年來，人們從菲牛蛭攝食與生長[9]、養(yǎng)殖方式[10]、病害防治[11]、繁殖[12]等方面做了很多工作，也取得了一些成效。在菲牛蛭養(yǎng)殖中，水蛭素活性作為菲牛蛭養(yǎng)殖產(chǎn)品質(zhì)量的評判標(biāo)準(zhǔn)。而關(guān)于不同體重菲牛蛭體內(nèi)水蛭素與氨基酸變化的規(guī)律未見相關(guān)報(bào)道。針對不同體重菲牛蛭，比較分析菲牛蛭中蛋白質(zhì)、氨基酸和水蛭素含量變化的規(guī)律，為將來菲牛蛭的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

氨基酸全自動分析儀（A300，德國曼默博爾公司）；pH 計(jì)（pHS-3D，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；冷凍干燥機(jī)（FD-1C-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；全自動凱氏定氮儀（SKD-1000，上海沛歐公司）。

1.2 試驗(yàn)材料

菲牛蛭由云南海瑞迪生物制藥有限公司提供，選擇活體體重分別為(2.00±0.10)、(4.00±0.10)、(6.00±0.10)、(8.00±0.10)、（10.00±0.10）g共計(jì)5組菲牛蛭，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)共計(jì)50 g活體樣品。將每組活體菲牛蛭直接放入液氮中進(jìn)行致死，立即用不銹鋼粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎后放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，制備成冷凍干燥粉，供分析檢測。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)的測定

使用凱氏定氮法測定，參照GB/T 9695.11—2008《肉及肉制品氮含量測定》。

1.3.2 水解氨基酸的測定

稱取(0.025±0.001) g 絕干樣品完全轉(zhuǎn)移至10 ml安瓿瓶中。往安瓿瓶內(nèi)加入10 ml 含0.1%苯酚的6 mol/l鹽酸溶液，用噴燈封管后將置于（110±1）℃烘箱中水解24 h，取出冷卻、開管。水解后的樣品取出冷卻至室溫，開管后，水解管用去離子水洗滌三次，用小漏斗和濾紙過濾定容至50 ml容量瓶中。吸取定容后的樣品2 ml，置石英坩堝內(nèi)60 ℃水浴鍋中蒸干，用2 ml 稀釋液溶解（稀釋液按氨基酸分析儀A300 中的通用方法制備），用0.22 μm 針頭過濾器過濾至自動進(jìn)樣瓶中，上機(jī)分析。

1.3.3 游離氨基酸的測定

稱?。?.10±0.01）g絕干樣品，加入5 ml的生理鹽水進(jìn)行勻漿，振蕩、超聲波提取20 min后置于沸水浴中水浴30 min，4 000 r/min離心10 min，過濾上清液至石英坩堝內(nèi)60 ℃水浴鍋中蒸干，用2 ml稀釋液溶解，用0.22 μm針頭過濾器過濾至自動進(jìn)樣瓶中，上機(jī)分析。

1.3.4 水蛭素含量的測定

稱?。?.10±0.01）g菲牛蛭絕干樣品，加入0.9%氯化鈉溶液3 ml，充分?jǐn)嚢韬蠼?0 min，然后在離心機(jī)上以4 000 r/min 離心20 min 后取上清液備用。量取試驗(yàn)液100 μl 于玻璃管中（5 mm×20 mm）中，加入0.5%（牛）纖維蛋白原緩沖液200 μl搖勻，在37 ℃水浴鍋中水浴加溫，以5 μl/min速度滴加凝血酶滴定液，緩緩搖勻至凝固，記錄滴定量，按照公式進(jìn)行計(jì)算[13]。

水蛭素含量=C1×V1/（C2×V2×W）

式中:水蛭素含量——含抗凝血酶活性(ATU/g)；

C1——凝血酶溶液的質(zhì)量濃度（NIH/ml）；

C2——供試品溶液的質(zhì)量濃度（g/ml）；

V1——消耗凝血酶溶液的體積（μl）；

V2——供試品溶液的加入量（μl）；

W——樣品質(zhì)量（g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在試驗(yàn)中所得到的數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用Spss19.0軟件對菲牛蛭體成分及水蛭素含量的各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。如果差異顯著，再進(jìn)行Duncan's法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體重菲牛蛭蛋白含量比較

按照1.3.1 蛋白質(zhì)測定方法對5 組菲牛蛭蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，蛋白含量見圖1。

圖1 菲牛蛭蛋白含量

從圖1中可以看出，不同體重菲牛蛭蛋白質(zhì)含量存在顯著差異（P＜0.05），2.00 g 和4.00 g 的菲牛蛭蛋白質(zhì)顯著低于6.00、8.00、10.00 g 的菲牛蛭（P＜0.05）。但是2.00 g 和4.00 g 間，6.00、8.00 g 和10.00 g 體重間的菲牛蛭蛋白含量差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同體重菲牛蛭水解氨基酸比較

按照1.3.2處理方法對不同體重菲牛蛭的水解氨基酸含量進(jìn)行測定，水解氨基酸分析圖譜見圖2～圖3，結(jié)果見表1。

圖2 水解氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

圖3 水解氨基酸樣品圖譜

表1 不同體重菲牛蛭水解氨基酸比較（絕干樣，%）

從上表1中可以看出，天冬氨酸和谷氨酸兩種氨基酸含量相對是最高的，蛋氨酸的含量是最低的。在17種水解氨基酸中，不同體重菲牛蛭中天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸這6種氨基酸含量存在顯著差異（P＜0.05），對其余11種氨基酸間沒有顯著差異（P＞0.05）。天冬氨酸含量以5組含量最高，比1組顯著高11.86%（P＜0.05），1、2、3、4組間，2、3、4、5組間天冬氨酸含量差異不顯著（P＞0.05）；甘氨酸含量以2 組最高，比4、5 組顯著高16.72%（P＜0.05）、24.07%（P＜0.05），1、2、3組間，1、3、4、5組間甘氨酸含量差異不顯著（P＞0.05）；蛋氨酸含量以4 組最高，1、2、3、5組間，1、2、4、5組間蛋氨酸含量差異不顯著（P＞0.05）；酪氨酸含量以3組最高，比2、4組中顯著高15.79%（P＜0.05）、10.34%（P＜0.05），在1、2、4組間，1、4、5組間、1、3、5組間酪氨酸含量差異不顯著（P＞0.05）；苯丙氨酸含量以3組最高，比2組顯著高9.89%（P＜0.05），1、3、4、5組間苯丙氨酸含量差異不顯著（P＞0.05）；4、5組中脯氨酸平均含量比1、2、3組脯氨酸平均含量高1.78%，1、2、3組間，4、5組間脯氨酸含量差異不顯著（P＞0.05）。

從氨基酸總含量來看，不同體重菲牛蛭中水解氨基酸含量總量存在顯著差異（P＜0.05），1、2組間，3、4、5 組間氨基酸總含量差異不顯著（P＞0.05），氨基酸總含量以4 組最高，分別比1、2 組顯著高7.21%（P＜0.05）、6.17%（P＜0.05）。

從藥用氨基酸總量看，不同體重菲牛蛭中藥用氨基酸總含量差異不顯著（P＞0.05），但是藥用氨基酸的總量相對比較高，平均達(dá)到40.78%，占到氨基酸總含量平均值的52.94%。

2.3 不同體重菲牛蛭游離氨基酸比較

按照1.3.3游離氨基酸的測定方法，分別對5組不同體重的菲牛蛭游離氨基酸進(jìn)行測定，氨基酸分析色譜圖見圖4～圖5，結(jié)果見下表2。

圖4 游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

圖5 游離氨基酸樣品圖譜

從表2中可以看出，不同體重菲牛蛭中游離氨基酸含量存在顯著差異（P＜0.05），谷氨酸、賴氨酸、丙氨酸、氯化銨、精氨酸、β-氨基正丁酸6種游離氨基酸含量相對是比較高的，各游離氨基酸中，不同體重菲牛蛭中除α-氨基正丁酸游離外，其余41 種游離氨基酸含量均存在顯著差異（P＜0.05）。

在41 種游離氨基酸含量中，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、β-氨基正丁酸、氯化銨、精氨酸這8種游離氨基酸呈現(xiàn)了相同的規(guī)律，隨著菲牛蛭個體逐漸增大，這8種游離氨基酸含量均呈現(xiàn)下降的趨勢。菲牛蛭體重顯著影響谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸、β-氨基正丁酸這5 種游離氨基酸的含量（P＜0.05），隨著菲牛蛭個體的增大，這5 種氨基酸的含量顯著的降低（P＜0.05）。

表2 不同體重菲牛蛭中游離氨基酸含量比較（mg/100 g）

從總游離氨基酸含量來看，菲牛蛭體重顯著影響總游離氨基酸的含量（P＜0.05），且隨著菲牛蛭體重的增加，游離氨基酸總量顯著的降低（P＜0.05）。

2.4 不同體重菲牛蛭水蛭素含量比較

水蛭素含量按照1.3.4 凝血酶滴定法進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 不同體重菲牛蛭中水蛭素含量比較[ATU/g（絕干樣）]

從3表可以看出，不同體重菲牛蛭中單位水蛭素含量存在差異，1、2 組間水蛭素含量差異不顯著（P＞0.05），2、3、4 組間差異不顯著（P＞0.05）。1 組水蛭素含量顯著高于3、4、5 組（P＜0.05）；隨著菲牛蛭體重的增加，菲牛蛭中水蛭素含量呈現(xiàn)一個逐漸下降的趨勢。

通過計(jì)算將絕干樣中的水蛭素含量換算成每條活體中的水蛭素含量，從每條菲牛蛭所含的水蛭素總量來看，隨著體重的增加，每條菲牛蛭中所含的水蛭素含量顯著的增加（P＜0.05），為了研究不同體重菲牛蛭中水蛭素含量的變化規(guī)律，將每條體重的菲牛蛭和所含的水蛭素含量進(jìn)行回歸分析，以菲牛蛭中水蛭素含量（y，ATU/g）為因變量，菲牛蛭體重（x，g/條）為自變量，得到如下數(shù)據(jù)擬合方程，見圖6。

圖6 菲牛蛭體重與水蛭素含量的回歸分析

圖7 菲牛蛭體重與水蛭素同比增加率

從圖6可以看出，菲牛蛭體重與其含有的水蛭素含量呈現(xiàn)對數(shù)函數(shù)關(guān)系，隨著菲牛蛭逐漸增大，個體菲牛蛭中所含的水蛭素含量呈現(xiàn)對數(shù)函數(shù)增加的趨勢，在體重達(dá)到一定體重，水蛭素含量緩慢的增加，從2.00 g體重增加4.00 g，水蛭素含量增加率是最高的，達(dá)到98.82%；從6.00 g 體重增加到8.00 g 時，水蛭素含量增加率趨于平緩，見圖7，在本試驗(yàn)的幾個體重范圍內(nèi)，體重越高，個體所含的水蛭素含量越高，體重達(dá)到8.00 g以后，水蛭素含量增加緩慢。

3 討論

由于組成蛋白質(zhì)的氨基酸在生物機(jī)體代謝中起著重要作用，故氨基酸分析常作為評價動物類藥材質(zhì)量的指標(biāo)之一，自然界中的氨基酸有20多種，其中天門冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、蛋氨酸（Met）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、賴氨酸（Lys）、苯丙氨酸（Phe）、精氨酸（Arg）等9 種氨基酸在一般植物中含量少，且有些人體內(nèi)不能合成，是維持機(jī)體氮平衡所必需的，稱為藥用氨基酸[14]。菲牛蛭中藥用氨基酸總含量相對比較高，平均達(dá)到40.78%，占到總氨基酸平均含量的52.94%，菲牛蛭所具有的預(yù)防與治療心血管疾病及降血脂的功效或許與藥用氨基酸含量高的特點(diǎn)有關(guān)。

劉麗芳等[15]采用HPLC-柱后衍生化法測定了寬體金線蛭氨基酸組成的變化，炮制前總氨基酸含量為73.94%，氨基酸含量最高的是亮氨酸，達(dá)到10.43%，其次為纈氨酸8.33%，而谷氨酸是除蛋氨酸、胱氨酸外含量較低的一種氨基酸，只占0.97%。戚敏等[16]研究表明，菲牛蛭中谷氨酸和天冬氨酸的含量是最高的兩種氨基酸。在本研究中發(fā)現(xiàn)，菲牛蛭的水解氨基酸中，谷氨酸和天冬氨酸也是相對較高的氨基酸，且不同體重菲牛蛭谷氨酸和天冬氨酸含量差異顯著，在動物和細(xì)胞研究中，谷氨酸和天冬氨酸可在機(jī)體組織細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)氨基和脫羧基等作用轉(zhuǎn)化為其他基底物質(zhì)(如谷胱甘肽、精氨酸、瓜氨酸和谷氨酰胺)發(fā)揮重要作用[17]。另外，谷氨酸和天冬氨酸是機(jī)體內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[18-19]，在醫(yī)學(xué)上谷氨酸、天冬氨酸用于降低血氨，消除自由氨的毒性作用，保護(hù)肝臟以及心臟，恢復(fù)其功能[20-21]。在游離氨基酸中，谷氨酸的含量是最高的，且隨著體重的增大呈顯著下降（P＜0.05）。李軍等[22]、丁月珠等[23]、張彬等[24]測定數(shù)種水蛭抗凝血效果時發(fā)現(xiàn):菲牛蛭抗凝血效果最佳；菲牛蛭、日本醫(yī)蛭等吸血蛭類抗凝血效果遠(yuǎn)高于非吸血蛭類的寬金線蛭。菲牛蛭等吸血蛭類的抗凝血效果或許與其氨基酸組成具有一定關(guān)系[16]。

汪波[25]研究發(fā)現(xiàn)，隨著菲牛蛭年齡的增加，每條菲牛蛭水蛭素活性物質(zhì)總含量是增加的，而單位質(zhì)量活性物質(zhì)含量卻是減少的，0.47 g 左右的幼體菲牛蛭單位質(zhì)量活性為（81±2.32）ATU，1.73 g左右亞成體菲牛蛭單位質(zhì)量活性為（56.82±1.29）ATU，成體菲牛蛭單位質(zhì)量活性在47 ATU左右，這與研究結(jié)果相一致，隨著體重的增加，菲牛蛭單位抗凝活性逐漸降低。菲牛蛭不僅具有抗凝血的效果，還具有抗血栓、抗腫瘤、抗炎、降血脂以及治療心腦血管疾病的功效[26]。研究發(fā)現(xiàn)，動物藥中的氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)不僅是營養(yǎng)成分，大多數(shù)被科學(xué)證實(shí)是動物藥中的特效成分[27]。從本研究的結(jié)果可以看出，不同體重菲牛蛭中蛋白質(zhì)、水解氨基酸、游離氨基酸及水蛭素含量均存在差異，且菲牛蛭的活體體重與其含有的水蛭素含量呈現(xiàn)對數(shù)函數(shù)關(guān)系，當(dāng)其體重達(dá)到8.00 g 時，其水蛭素含量呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢，可為菲牛蛭人工養(yǎng)殖中篩選最佳體重提供依據(jù)。

4 結(jié)論

不同體重菲牛蛭間蛋白質(zhì)、水解氨基酸、游離氨基酸及水蛭素含量存在差異。在17 種水解氨基酸中，不同體重菲牛蛭中天冬氨酸，甘氨酸，蛋氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸這6 種氨基酸存在顯著差異（P＜0.05），在41種游離氨基酸中除α-氨基正丁酸外，不同體重菲牛蛭中40種游離氨基酸的含量均有顯著差異（P＜0.05）；不同體重菲牛蛭中水蛭素含量差異顯著（P＜0.05），且菲牛蛭體重與其含有的水蛭素含量呈現(xiàn)對數(shù)函數(shù)關(guān)系，當(dāng)菲牛蛭體重達(dá)到8.00 g 以上時，其水蛭素含量呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢，養(yǎng)殖中至少篩選體重＞8.00 g以上的菲牛蛭能達(dá)到較高的價值。