曹 霞 鄭秉武 丁玉林 甘 迪 劉淑英 王金玲*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特，010018；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特，010018；3.呼和浩特市園林管理局動(dòng)物園管理處，呼和浩特，010050)

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒引起的一種以致死性腦炎為特征的人畜共患性傳染病[1]?？袢V泛流行于世界各地，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)報(bào)道全球每年有6萬(wàn)多人和數(shù)百萬(wàn)的動(dòng)物死于狂犬病，我國(guó)每年因狂犬病死亡的人和動(dòng)物數(shù)量?jī)H次于印度居世界第二[2]。近些年，內(nèi)蒙古自治區(qū)不同動(dòng)物源狂犬病一直發(fā)生，2009—2012年從內(nèi)蒙古地區(qū)分離到19株不同動(dòng)物源狂犬病病毒[3-5]?？袢∫恢痹谕{著動(dòng)物和人類的生命安全。2015年底，內(nèi)蒙古自治區(qū)某動(dòng)物園3只美洲駝相繼出現(xiàn)神經(jīng)癥狀并陸續(xù)死亡，作者采用多種方法確診為狂犬病。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3只病死成年美洲駝(Lamaglama)，病例號(hào)分別11465、11478和11487，由內(nèi)蒙古自治區(qū)某野生動(dòng)物園提供。

1.2 臨床癥狀觀察和尸體剖檢

通過詢問動(dòng)物園獸醫(yī)和現(xiàn)場(chǎng)觀察，記錄發(fā)病美洲駝的臨床癥狀。對(duì)病死美洲駝全面尸檢，觀察和記錄大體病變。剖檢過程中分別取大腦、小腦、延腦、腦干、海馬和脊髓等全身各組織器官，大小為1.5 cm×1 cm×0.5 cm左右，立即放入10%中性福爾馬林溶液中固定。

1.3 病理組織切片制備和觀察

組織固定24 h后進(jìn)行修塊、脫水和透明，石蠟包埋，切片厚度為4 μm，蘇木素-伊紅染色(HE)，制備病理組織切片和進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

1.4 狂犬病病毒特異性抗原檢查

1.4.1 直接免疫熒光試驗(yàn)(DFA)

在生物安全柜內(nèi)，用無菌鑷子分別取少量3只美洲駝新鮮小腦組織放在清潔載玻片上，用鑷子捻成糊狀并均勻涂在載玻片上，再用無菌吸紙粘去多余的腦組織，使載玻片上形成薄層半透明的腦組織膜，將載玻片放入4 ℃預(yù)冷的丙酮內(nèi)10 min，取出后自然干燥，用熒光標(biāo)記的狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體(CHEMICON，rabies DFA reagent)滴到載玻片腦組織上，室溫孵育30 min，PBS 漂洗3 次，1 min/次，最后50%甘油封片。熒光顯微鏡觀察，若腦組織內(nèi)出現(xiàn)亮綠色的熒光信號(hào)判為陽(yáng)性。同時(shí)以健康腦組織為陰性對(duì)照。

1.4.2 免疫組織化學(xué)

4 μm厚度的美洲駝腦組織石蠟切片在40 ℃和50 ℃分別烤片3 h，梯度酒精脫蠟與水化，切片放入沸騰的0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中反應(yīng)15 min進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后放入TBS-T液搖洗3次，3 min/次。在組織上滴加適量的3%H2O2，濕盒中室溫靜置30 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，TBS-T液中搖洗3次，3 min/次。加適量的封閉山羊血清工作液于組織上，37 ℃濕盒內(nèi)靜置30 min。傾去血清，勿洗，并將組織周圍的殘留血清擦干。在組織上添加適量的狂犬病病毒ERA株弱毒疫苗免疫小鼠獲得的多克隆抗體(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供)，4 ℃過夜，再放入37 ℃溫箱復(fù)溫30 min，傾倒多抗后用TBS-T液搖洗3次，3 min/次。二抗37 ℃靜置15 min，再放入TBS-T液中搖洗3次，3 min/次。滴加辣根標(biāo)記液，37 ℃10 min，TBS-T液搖洗3次，3 min/次。DAB顯色5—20 min，放入蘇木素復(fù)染5 min和自來水沖洗。最后脫水、透明和中性樹膠封片?？瞻讓?duì)照組用PBS液代替多抗。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

2015年11月3日，1只成年雄性美洲駝(11465)突然出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，狂躁不安，亂跑，撕咬同群其他美洲駝，爬跨動(dòng)作頻繁，后期四肢麻痹，臥地不起，于11月4日9：00死亡，病程2 d。2015年12月8日，1只于2015年11月3日被咬傷肩部和四肢的成年雌性懷孕美洲駝(11478)突然發(fā)病，癥狀與11465號(hào)美洲駝相似，于12月9日死亡，病程2 d，疾病潛伏期34 d。2015年12月20日又1只于2015年11月3日成年雌性懷孕美洲駝(11487)突然四肢癱瘓，臥地不起，食欲廢絕，輕度流涎，對(duì)外界刺激較敏感，無狂暴的神經(jīng)癥狀，體溫38.4 ℃，于2015年12月26日死亡，病程7 d，疾病潛伏期41 d。

2.2 大體病變

3只美洲駝尸體均明顯角弓反張，全身各組織器官嚴(yán)重的淤血；心衰明顯，心臟橫徑明顯增寬，心肌質(zhì)軟；肝腫大，呈土黃色，質(zhì)軟易碎；腦脊液增多，腦輕度水腫。其他組織無明顯病變。

2.3 病理組織學(xué)變化

3只美洲駝主要病變相似，在小腦多數(shù)浦金野細(xì)胞(圖1)、大腦多形細(xì)胞、海馬多形細(xì)胞、腦干神經(jīng)細(xì)胞(圖2)和脊髓多極運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞漿內(nèi)均可見大小不等的均質(zhì)紅染的圓形、橢圓形的狂犬病病毒包涵體，腦小血管周圍出血灶多見。11487號(hào)美洲駝腦組織典型的非化膿性腦炎，腦組織部分小血管周圍有明顯的淋巴細(xì)胞“管套”。多數(shù)心肌細(xì)胞輕度至中度的細(xì)胞腫脹。其他組織出現(xiàn)程度不同的淤血和水腫。

圖1 美洲駝小腦浦金野細(xì)胞漿內(nèi)圓形的嗜酸性狂犬病病毒包涵體(HE×400)Fig.1 Eosinophilic Negri body within the cytoplasm of the cerebellum Purkinje’s cells(HE×400)

2.4 狂犬病病毒特異性抗原檢查結(jié)果

2.4.1 DFA結(jié)果

在陰性對(duì)照成立的情況下，在3只病死美洲駝小腦組織內(nèi)檢測(cè)到典型的亮綠色的狂犬病病毒抗原的特異性陽(yáng)性信號(hào)(圖3)。

圖2 美洲駝腦干神經(jīng)細(xì)胞漿內(nèi)圓形均質(zhì)的嗜酸性狂犬病病毒包涵體(HE×400)Fig.2 Eosinophilic Negri body within the cytoplasm of the neurocyte in the brain stem(HE×400)

圖3 美洲駝小腦組織大量大小不等的亮綠色的特異性狂犬病病毒抗原陽(yáng)性信號(hào)(DFA×400)Fig.3 A number of bright green，positive signals of rabies virus antigen in the cerebellum tissues of llama(DFA×400)

2.4.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

在3只病死美洲駝的小腦浦金野細(xì)胞的胞漿內(nèi)檢測(cè)到大小不等的圓形、橢圓形的典型的棕色狂犬病病毒抗原的特異性陽(yáng)性信號(hào)(圖4)。

圖4 美洲駝小腦浦金細(xì)胞漿內(nèi)圓形和橢圓形的棕色狂犬病病毒抗原陽(yáng)性信號(hào)(IHC，標(biāo)尺=10 μm)Fig.4 The round，oval brown signals of rabies antigen in the cytoplasm of cerebellum Purkinje’s cell of llama(IHC，Bar=10 μm)

3 討論

狂犬病病毒可以感染包括人類在內(nèi)的所有溫血?jiǎng)游?，并引起致死性病毒性腦炎[6]。關(guān)于美洲駝狂犬病的自然病例罕有報(bào)道，自從1990年美國(guó)俄克拉荷馬州疾病控制中心首次報(bào)道了美洲駝狂犬病[7]至今，世界上還未再有美洲駝狂犬病的報(bào)道?？袢【哂凶C病意義的病理變化是在腦神經(jīng)細(xì)胞漿中觀察到大小不等的嗜酸性病毒包涵體[8-9]。在本研究中診斷的3例病死美洲駝的小腦浦金野細(xì)胞、腦干多極神經(jīng)元、大腦多形細(xì)胞和海馬多形細(xì)胞胞漿內(nèi)均觀察到典型的大小不等的嗜酸性的狂犬病病毒包涵體?？袢〉脑\斷方法還可通過DFA和免疫組織化學(xué)方法，DFA方法也是WHO公認(rèn)的狂犬病的確診方法[6]。本研究通過DFA方法在小腦組織內(nèi)均檢測(cè)狂犬病病毒抗原亮綠色的特異性陽(yáng)性信號(hào)[3]。同時(shí)又通過免疫組織化學(xué)方法在小腦浦金野細(xì)胞胞漿內(nèi)均檢測(cè)到典型的大小不等的棕色特異性狂犬病病毒抗原陽(yáng)性信號(hào)[8]。

組織病理學(xué)上，不是所有狂犬病動(dòng)物都會(huì)表現(xiàn)典型的病毒性腦炎[4]。本研究診斷的3只美洲駝中，僅11487號(hào)美洲駝腦組織表現(xiàn)出以淋巴細(xì)胞性“管套”為主要病變的病毒性腦炎。從病程分析，11465號(hào)和11478號(hào)美洲駝的病程均為2 d，病程短，機(jī)體損傷與抗損傷斗爭(zhēng)時(shí)間短，淋巴細(xì)胞還未來得及滲出或滲出少，炎癥變化表現(xiàn)不明顯；而11487號(hào)美洲駝病程為7 d，病程長(zhǎng)，機(jī)體損傷與抗損傷斗爭(zhēng)時(shí)間長(zhǎng)，炎性細(xì)胞滲出多，腦炎病變明顯。

人和動(dòng)物狂犬病絕大多數(shù)都是由犬咬傷引起[6]。據(jù)調(diào)查，發(fā)病的動(dòng)物園內(nèi)流浪犬可自由進(jìn)入，特別是夜晚，因此，可以推測(cè)最初發(fā)病的11465號(hào)美洲駝與狂犬病帶毒犬的咬傷相關(guān)。針對(duì)狂犬病的防控主要兩個(gè)方面，一方面是進(jìn)行狂犬病疫苗免疫，另一方面是切斷與帶毒犬的接觸。目前，我國(guó)還沒有針對(duì)家畜和野生動(dòng)物狂犬病的專用疫苗，有條件的動(dòng)物園可以用犬狂犬病疫苗進(jìn)行暴露前后的疫苗免疫，并建議定期免疫。同時(shí)，采取措施嚴(yán)格控制流浪犬入園，杜絕與流浪犬的接觸。